賈 麗

河北省邯鄲市中心醫(yī)院(邯鄲 056001)

子宮內(nèi)膜癌是一種上皮性惡性腫瘤，約占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的25%，并且呈現(xiàn)發(fā)病率逐年上升和年輕化趨勢[1-2]。手術(shù)切除輔助放化療等綜合治療方案能夠改善患者生活質(zhì)量并延長生存期，早期子宮內(nèi)膜癌患者5年生存率能夠達到80%，但晚期患者5年生存率卻不足50%[3]，而多數(shù)患者死于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移所致并發(fā)癥[4]。因此，以抑制子宮內(nèi)膜癌侵襲、遷移為靶點的藥物開發(fā)成為研究的熱點。

大蒜素天然存在于百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖，主要成分為二烯丙基三硫化物，近年來大蒜素抗腫瘤活性得到關(guān)注，對胃癌[5]、肺癌[6]、人舌鱗狀細胞癌[7]、宮頸癌[8]等均具有抑制作用，本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞生長、促進其凋亡、增強其順鉑化療敏感性的作用[9-10]，但是否能夠抑制其侵襲和遷移尚待研究。本實驗以Ishikawa細胞為受試細胞，研究大蒜素對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和遷移的影響并探索其可能的作用機制。

材料與方法

1 細 胞 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株由河北醫(yī)科大學病理教研室提供。

2 藥物與試劑 大蒜素注射液(規(guī)格：5 ml∶60 mg，批號：4E41025)；順鉑注射液(規(guī)格：2 ml∶10 mg，批號：1905016)；CCK-8試劑盒(蘇州宇恒生物有限公司)；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、鈣粘附蛋白(E-cadherin)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體以及BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；碘化丙啶(美國Sigma-Aldrich公司)；ECL超敏化學發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

3 主要儀器 MCO-15AC型CO2細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；CyFlow Counter流式細胞儀(德國Partec公司)；Multiskan Asent型酶標儀(芬蘭Labsysterms公司)；Tetra Systerm型垂直電泳槽、Power Pac Basic轉(zhuǎn)膜槽、GelDoc EZ型凝膠成像系統(tǒng)、TC20型細胞計數(shù)器(美國Bio-Rad公司)；Eclipse TS100型倒置光學顯微鏡(日本Nikon公司)。

4 細胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株經(jīng)解凍復蘇后接種于含10%胎牛血清、雙抗(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基，置CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：5%二氧化碳、恒溫37 ℃、飽和濕度)，每2天換液1次，取對數(shù)生長期Ishikawa細胞進行實驗研究。

5 CCK-8法測定Ishikawa細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期Ishikawa細胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)、制備濃度為5×104個/ml的單細胞懸液后接種于96孔板(100 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細胞貼壁生長后，設空白對照組(DMSO)，大蒜素低、中、高劑量組(12.5、25、50 μg/ml)和順鉑組(40 μg/ml)，每組10個復孔，分別給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑(10 μl/孔)，孵育2 h后通過酶標儀測定450 nm處吸光度值(OD450nm)，增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD450nm/空白對照組OD450nm)×100%。

6 PI染色流式細胞術(shù)分析Ishikawa細胞周期分布 取對數(shù)生長期Ishikawa細胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)、制備的濃度5×104個/ml的Ishikawa單細胞懸液，接種于6孔板，設空白對照組(DMSO)，大蒜素低、中、高劑量組(12.5、25、50 μg/ml)和順鉑組(40 μg/ml)，每組10個復孔，分別給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后胰酶消化、離心5 min(1500 rpm，離心半徑r=10 cm)取細胞，經(jīng)4 ℃預冷PBS溶液洗滌、70%乙醇固定1 h、預冷PBS溶液洗滌后，加入預冷PBS溶液200 μl重懸細胞，加入PI染液避光孵育0.5 h后通過流式細胞儀分析細胞周期分布。

7 Transwell小室法測定Ishikawa細胞侵襲能力[11]Transwell小室有上、下室構(gòu)成，上室加50 μl無添加胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基，經(jīng)37℃放置4 h后吸出基質(zhì)膠表面液體；下室加500 μl 含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；取對數(shù)生長期Ishikawa細胞經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml，設空白對照組(DMSO)，大蒜素低、中、高劑量組(12.5、25、50 μg/ml)和順鉑組(40 μg/ml)，分別給藥并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后將細胞移到Transwell上室，每組設10孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將侵入Transwell下室的Ishikawa細胞經(jīng)甲醛溶液固定20 min后加入結(jié)晶紫染色10 min，PBS溶液沖洗后通過倒置顯微鏡觀察，均隨機選5個視野計數(shù)細胞取平均值。

8 劃痕實驗測定Ishikawa細胞遷移能力 對數(shù)生長期Ishikawa細胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)、制備的濃度5×104個/ml的Ishikawa單細胞懸液，接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞貼壁并融合后，用無菌10 μl槍頭于孔底部劃一條直線，用37 ℃的PBS沖洗2次，通過顯微鏡觀察并測量劃痕寬度(L0)，設空白對照組(DMSO)，大蒜素低、中、高劑量組(12.5、25、50 μg/ml)和順鉑組(40 μg/ml)，分別給藥并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，再次通過顯微鏡觀察、拍照并測量劃痕寬度(L)。遷移率(%)=[(L0-L)/L0]×100%。

9 Western blot法檢測Ishikawa細胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin、PI3K、p-Akt蛋白表達 取對數(shù)生長期Ishikawa細胞經(jīng)胰酶消化后離心5 min(1500 rpm，離心半徑r=10 cm)取細胞，超聲破碎處理后4 ℃ 12000 rpm離心20 min后棄上清，BCA法測定蛋白總含量后，沸水浴高溫變性，Western blot法測定蛋白表達：取30 μg總蛋白上樣、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，恒溫4 ℃一抗孵育12 h，洗膜后二抗37 ℃孵育1 h，洗膜后滴加ECL顯色發(fā)光，運用凝膠成像系統(tǒng)獲得條帶；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量MMP-2、MMP-9、E-cadherin、PI3K、p-Akt蛋白表達，如：MMP-2相對表達量=MMP-2的灰度值/內(nèi)參β-actin的灰度值。

結(jié) 果

1 各組Ishikawa細胞增殖抑制率測定結(jié)果 經(jīng)大蒜素低、中、高劑量或順鉑干預48 h能夠提高Ishikawa細胞增殖抑制率，較空白對照組差異有統(tǒng)計學意義[(10.85±0.72)%、(25.37±1.39)%、(54.16±3.08)%、(35.41±1.85)%比(0.00±0.00)%，P<0.01]；大蒜素高劑量組Ishikawa細胞增殖抑制率顯著高于順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義[(54.16±3.08)%比(35.41±1.85)%，P<0.01]。

2 各組Ishikawa細胞周期分布測定結(jié)果 見表1。經(jīng)大蒜素低、中、高劑量或順鉑干預48 h能夠提高Ishikawa細胞處于G0/G1期的比例而降低S期細胞比例，較空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，各組G2/M期Ishikawa細胞比例與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；大蒜素高劑量組Ishikawa細胞處于G0/G1期比例高于順鉑組、S期比例低于順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組間G2/M期比例比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞周期分布(%)

3 各組Ishikawa細胞侵襲能力測定結(jié)果 見表2(圖1)。大蒜素低、中、高劑量或順鉑干預48 h能夠降低穿過Transwell小室的Ishikawa細胞數(shù)量，較空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大蒜素高劑量組Ishikawa細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)量低于順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義。

A：空白對照組；B：大蒜素低劑量組；C：大蒜素中劑量組；D：大蒜素高劑量組；E：順鉑組

4 各組Ishikawa細胞遷移能力測定結(jié)果 見表2(圖2)。大蒜素中、高劑量或順鉑干預48 h能夠降低Ishikawa細胞遷移率，較空白對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大蒜素高劑量組Ishikawa細胞遷移率低于順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義。

A：空白對照組；B：大蒜素低劑量組；C：大蒜素中劑量組；D：大蒜素高劑量組；E：順鉑組

表2 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞侵襲能力和遷移能力

5 各組Ishikawa細胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達測定結(jié)果 見表3(圖3)。大蒜素中、高劑量或順鉑干預48 h能夠下調(diào)Ishikawa細胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達量，較空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大蒜素高劑量組Ishikawa細胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達量低于順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義。

表3 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達

A：空白對照組；B：大蒜素低劑量組；C：大蒜素中劑量組；D：大蒜素高劑量組；E：順鉑組

6 各組Ishikawa細胞PI3K、p-Akt蛋白表達測定結(jié)果 見表4(圖4)。大蒜素中、高劑量或順鉑干預48 h能夠下調(diào)Ishikawa細胞PI3K、p-Akt蛋白表達量，較空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大蒜素高劑量組Ishikawa細胞PI3K、p-Akt蛋白表達量低于順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義。

A：空白對照組；B：大蒜素低劑量組；C：大蒜素中劑量組；D：大蒜素高劑量組；E：順鉑組

表4 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞PI3K、p-Akt蛋白表達

討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，隨著我國人口老齡化加劇、肥胖人群數(shù)量增加等因素，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率逐年上升，并且年輕患者數(shù)量和比例增加顯著，嚴重威脅著女性的生命健康。近年來，雖然手術(shù)及放化療技術(shù)有了很大進步，但阻滯子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移仍是有待解決的難題，而超過90%的死亡病例是由于癌細胞轉(zhuǎn)移所致嚴重并發(fā)癥，所以能夠有效抑制子宮內(nèi)膜癌侵襲、遷移的新藥研究具有重要臨床意義。

大蒜為百合科蔥屬植物，不僅是常用的食用調(diào)味品，而且其鱗莖可以入藥，性溫，味辛、甘，具有溫中健胃、消食理氣之功效。大蒜素是大蒜鱗莖的主要活性成分，具有廣泛的抗腫瘤活性，并且隨著近代藥理學研究的深入，發(fā)現(xiàn)大蒜素對人膽管癌RBE細胞[12]、人結(jié)腸癌LoVo細胞[13]、人胰腺癌EMT細胞[14]等侵襲、遷移具有明顯抑制作用。本實驗以人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞為受試細胞并以子宮內(nèi)膜癌化療一線用藥順鉑為陽性對照，結(jié)果顯示：經(jīng)大蒜素干預能夠明顯提高Ishikawa細胞增殖抑制率、阻滯細胞周期于G0/G1期而影響細胞周期進程、降低Ishikawa細胞侵襲細胞數(shù)和遷移率，提示大蒜素具有抑制Ishikawa細胞增殖、侵襲和遷移的作用。

腫瘤細胞侵襲和遷移過程非常復雜，細胞外基質(zhì)(ECM)降解是其最主要的環(huán)節(jié)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)對ECM具有較為強大的催化降解作用[15]，其中MMP-2、MMP-9能夠催化降解多種膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等ECM中幾乎所有成分[16]，從而促進腫瘤細胞浸潤基底膜、向周圍組織侵襲和遷移，進而形成轉(zhuǎn)移灶[17]。E-cadherin是廣泛存在于上皮細胞的一種Ca2+依賴的Ⅰ型跨膜糖蛋白，與細胞間連接、細胞形態(tài)維持、細胞間信號轉(zhuǎn)導密切相關(guān)[18]，對腫瘤細胞侵襲和遷移具有顯著的抑制作用，E-cadherin表達量降低將導致腫瘤細胞細胞間連接功能失調(diào)而增加其侵襲性[19]。PI3K參與細胞存活、生長、代謝、凋亡等過程的調(diào)節(jié)，Akt是PI3K的靶基因，被PI3K活化轉(zhuǎn)變?yōu)閜-Akt后做為第二細胞信使參與腫瘤細胞的侵襲和遷移[20-21]，所以PI3K/Akt通路對腫瘤細胞侵襲和遷移具有重要的調(diào)控作用。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素干預能夠有效降低Ishikawa細胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin、PI3K、p-Akt蛋白表達量，這可能是大蒜素抑制Ishikawa細胞侵襲和遷移的重要分子機制。

綜上所述，大蒜素具有抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞侵襲和遷移的藥理學作用；其機制可能與大蒜素阻滯細胞周期進程而抑制細胞增殖，降低MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達以及抑制PI3K/Akt通路活性有關(guān)。