李靜靜，孫 勇，張素梅

1.安徽公安職業(yè)學(xué)院公安科學(xué)技術(shù)系，安徽合肥,230031;2.合肥市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，安徽合肥,230061;3.安徽醫(yī)科大學(xué)生化教研室，安徽合肥,230032

肺癌是最常見(jiàn)的肺原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)迅速，對(duì)人群健康和生命造成嚴(yán)重威脅[1]。近半個(gè)世紀(jì)來(lái)，肺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)，尤其是在發(fā)達(dá)國(guó)家。肺癌的病死率也呈逐年上升的趨勢(shì)，在男性中肺癌位居男性癌癥死因首位[2]。當(dāng)傳統(tǒng)的手術(shù)切除腫瘤、放化療等方法達(dá)不到預(yù)期療效時(shí)，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始積極探索靶向治療、免疫治療以及高壓氧等其他輔助治療措施的使用。

研究表明，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)是處于缺氧狀態(tài)的，實(shí)體瘤因其迅速生長(zhǎng)而導(dǎo)致實(shí)體瘤組織內(nèi)氧供不足，造成缺氧微環(huán)境[3]。實(shí)體瘤所處的缺氧微環(huán)境會(huì)影響腫瘤細(xì)胞中一些基因的表達(dá)，包括表達(dá)和激活新生血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤新生血管的生成。同時(shí)，缺氧環(huán)境也會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)和激活眾多的促腫瘤生存因子，使腫瘤細(xì)胞惡性程度增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，并引起腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的耐受和抵抗[4]。那么能否通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞體內(nèi)的缺氧微環(huán)境達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制甚至滅活？高壓氧可以增加腫瘤的氧氣灌注，從而改變腫瘤的缺氧微環(huán)境，這種高壓狀態(tài)下施用的氧氣還能夠阻礙腫瘤細(xì)胞的脫氧核糖核酸合成，引起脫氧核糖核酸損傷并抑制細(xì)胞的分裂[5]。

國(guó)際上常用二氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞缺氧環(huán)境。CoCl2抑制脯氨酸羥化酶的羥化作用，阻礙氧信號(hào)的傳導(dǎo)，同時(shí)鈷離子能夠競(jìng)爭(zhēng)血紅蛋白成分中的亞鐵離子，阻礙形成氧合血紅蛋白，降低血液攜氧能力，從而誘發(fā)細(xì)胞缺氧的系列癥狀[6]。此次實(shí)驗(yàn)中首先用CoCl2處理肺癌A549細(xì)胞，模擬腫瘤細(xì)胞缺氧微環(huán)境，再用高壓氧進(jìn)行處理。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察A549細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后遷移能力的變化，同時(shí)Western blot檢測(cè)JNK、p-JNK蛋白表達(dá)情況，初步探討其可能的分子機(jī)制，為治療或緩解肺癌提供一個(gè)新的方案或思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌細(xì)胞A549為本實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃、飽和濕度。

1.2 細(xì)胞分組情況

將A549細(xì)胞分為4組：細(xì)胞對(duì)照組(cell)、CoCl2處理組(CoCl2)、高壓氧處理組(HBO)、CoCl2和高壓氧處理組(CoCl2+HBO)。

1.3 主要試劑及儀器

二氯化鈷(CoCl2)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和二甲亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Clark Bioscience公司；BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自美國(guó) Pierce公司；抗人β-actin、JNK和p-JNK特異性抗體均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；增強(qiáng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó) Thermo Scientific公司。高壓氧艙(山東煙臺(tái)，GY3600)；倒置顯微鏡(Leica DMI 3000B);電泳儀(北京六一儀器廠，DYYTC)。

1.4 高壓氧處理

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行如下高壓氧處理，每天一次，總共兩次。高壓氧艙每次紫外線消毒15 min，并純氧洗艙。細(xì)胞在無(wú)菌條件下平放進(jìn)行高壓吸氧90 min分鐘，其中15 min升壓，60 min恒壓，15 min減壓。在此過(guò)程中，HBO室的氧氣流量為2 L/min。高壓氧處理后細(xì)胞繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

待培養(yǎng)瓶中的A549細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%密度時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，用0.25%胰酶1 mL消化細(xì)胞，加入1 mL完全1640培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打使成為單細(xì)胞懸液后，吸取合適體積置于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含10%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，然后將細(xì)胞懸液種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔種植200 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁，次日小心吸盡96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入含有不同濃度CoCl2(50、100、200、300 μM)的完全1640培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、DMSO對(duì)照組，在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。向每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃溫育4 h后，小心棄去上清液，控干。向每孔中加入100 μL DMSO，將96孔培養(yǎng)板放于恒溫振蕩器中37 ℃振蕩10 min，以徹底溶解細(xì)胞培養(yǎng)板中的結(jié)晶物，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度值(OD值)，設(shè)定波長(zhǎng)為570 nm。抑制率計(jì)算公式為：抑制率%=(對(duì)照孔OD570-實(shí)驗(yàn)孔OD570)/對(duì)照孔OD570× 100%。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。根據(jù)不同濃度CoCl2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況選取合適的CoCl2進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞遷移能力

將肺癌A549細(xì)胞接種至兩塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用無(wú)菌槍頭在單層細(xì)胞底部中央位置劃出“十”字劃痕，小心吸棄培養(yǎng)基后，用無(wú)菌PBS小心洗去死細(xì)胞，顯微鏡下拍照，記為“0 h”。加入新鮮培養(yǎng)基并將兩塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別給予不同處理，每塊6孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞都被分為細(xì)胞對(duì)照組和CoCl2(50 μM)處理組，其中一塊6孔板同時(shí)給予每天一次HBO處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后分別觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并在顯微鏡下拍照記為“24 h”“48 h”。用Quantity One軟件分別測(cè)量0 h、24 h和48 h的細(xì)胞劃痕邊界之間的距離，0 h的距離減去24 h或48 h的距離即為24 h或48 h的細(xì)胞遷移距離。

1.7 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

經(jīng)上述處理(處理方法同細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))的各組A549細(xì)胞，用PBS洗3遍，每瓶加入300 μL RIPA蛋白裂解液，冰上放置30 min后用細(xì)胞刮子充分刮下細(xì)胞并吸取轉(zhuǎn)移至標(biāo)1.5 mL EP管中。為使細(xì)胞充分裂解，將收取的細(xì)胞裂解液放置于-80 ℃冰箱，完全冷凍后取出放于4 ℃融解，如此反復(fù)凍融3次后用4 ℃高速冷凍離心機(jī)在14 000 r / min轉(zhuǎn)速下離心30 min。吸取離心后的細(xì)胞裂解上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)每組細(xì)胞裂解上清液的總蛋白進(jìn)行定量并計(jì)算蛋白濃度，用RIPA蛋白裂解液調(diào)整所有蛋白樣品的濃度為同一濃度，加入蛋白上樣緩沖液并充分混勻，將各管放于沸水中10 min，冷卻后每組取等量的蛋白樣品上樣至12.5%濃度的聚丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，用p-JNK、JNK、β-actin的抗體4 ℃下孵育過(guò)夜。用含0.05% Tween-20的TBS洗滌3次以去除非特異結(jié)合的抗體，每次洗滌10 min，然后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。用TBS充分洗膜后，用ECL發(fā)光試劑盒顯影獲取對(duì)應(yīng)的特異性條帶。用Quantity One軟件測(cè)定各特異性條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，分別計(jì)算p-JNK、JNK的相對(duì)灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，p<0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的CoCl2對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果表明，隨著CoCl2濃度的增高，抑制率有逐漸上升的趨勢(shì)。除50 μM組細(xì)胞抑制率為24%，其他組別均大于30%(圖1)。因此選取50 μM為此后CoCl2的實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 高壓氧對(duì)缺氧肺癌細(xì)胞遷移能力的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，單獨(dú)CoCl2處理促進(jìn)細(xì)胞遷移，單獨(dú)高壓氧處理明顯抑制細(xì)胞遷移，CoCl2缺氧處理后高壓氧處理可以逆轉(zhuǎn)CoCl2促進(jìn)A549細(xì)胞遷移的能力(圖2)。

圖2 不同處理對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響與細(xì)胞對(duì)照組相比*p<0.05，與CoCl2組相比#p<0.05

2.3 CoCl2、高壓氧處理對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)JNK、p-JNK表達(dá)的影響

相對(duì)于細(xì)胞對(duì)照組，單獨(dú)CoCl2處理組p-JNK表達(dá)量上升，高壓氧單獨(dú)處理組p-JNK表達(dá)量降低。而CoCl2和高壓氧共同處理組相較于細(xì)胞對(duì)照組和單獨(dú)CoCl2處理組p-JNK表達(dá)量也降低,見(jiàn)圖3。

圖3 不同處理對(duì)A549細(xì)胞JNK、p-JNK蛋白表達(dá)的影響與細(xì)胞對(duì)照組相比*p<0.05，與CoCl2組相比#p<0.05

3 討 論

過(guò)度無(wú)限制的增殖是腫瘤細(xì)胞的主要特征之一，腫瘤細(xì)胞的快速增殖使腫瘤細(xì)胞處于一個(gè)持續(xù)的相對(duì)低氧狀態(tài)的微環(huán)境，而腫瘤細(xì)胞為應(yīng)對(duì)這種低氧狀態(tài)而進(jìn)行的一系列基因表達(dá)和代謝的變化又進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移能力[7]。高壓氧療法(HBO)是一種被廣泛應(yīng)用于臨床治療的有效方法，包括一氧化碳中毒、顱腦損傷、軟組織嚴(yán)重感染壞死和減壓病等疾病。已有眾多研究證實(shí)，HBO有化療或者放療增敏作用，可與化療或者放療聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療，是一種能有效增強(qiáng)其他治療方法效果的輔助治療方法[8]。本研究探討HBO的聯(lián)合抗腫瘤作用是否與緩解腫瘤細(xì)胞缺氧所致的腫瘤惡性程度增加和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。

通過(guò)不同處理組細(xì)胞遷移結(jié)果看，單獨(dú)CoCl2誘導(dǎo)缺氧組遷移距離較正常細(xì)胞組增加，說(shuō)明體內(nèi)缺氧微環(huán)境增加了A549細(xì)胞的不穩(wěn)定性，促進(jìn)其遷移擴(kuò)散。施加高壓氧處理后，細(xì)胞遷移距離明顯縮短，說(shuō)明高壓氧抑制了缺氧微環(huán)境下的肺癌A549細(xì)胞的遷移甚至擴(kuò)散。

高壓氧抑制缺氧的肺癌A549細(xì)胞遷移是本試驗(yàn)中最直觀的結(jié)果，用Western blot檢測(cè)JNK磷酸化水平的變化以進(jìn)一步探討高壓氧抑制缺氧肺癌A549細(xì)胞的遷移的可能分子機(jī)制。絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其重要成員之一c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminlki-nase，JNK)，可參與調(diào)控細(xì)胞對(duì)內(nèi)源和外源應(yīng)激因素的反應(yīng)，因此也被稱為應(yīng)激激活蛋白激酶。JNK信號(hào)通路可被眾多刺激物激活，在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。近年來(lái),已在宮頸癌、肝癌、星形細(xì)胞瘤、前列腺癌、乳腺等多種腫瘤發(fā)現(xiàn)了JNK異常表達(dá)[10-14]。在本實(shí)驗(yàn)中，CoCl2處理后的A549細(xì)胞JNK的磷酸化水平升高，而高壓氧則降低JNK的磷酸化水平。

就目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，缺氧微環(huán)境下肺癌細(xì)胞A549遷移能力增加，進(jìn)行高壓氧處理可以抑制其遷移能力，且缺氧狀態(tài)下肺癌細(xì)胞A549的JNK磷酸化水平增加，高壓氧可以降低其JNK的磷酸化水平。但是高壓氧逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)肺癌細(xì)胞A549的作用是否還有其他信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，JNK通路具體發(fā)揮怎樣的作用還有待進(jìn)一步的研究。