活血化痰膠囊對(duì)血管性癡呆大鼠海馬區(qū)B淋巴細(xì)胞瘤-2表達(dá)的影響*

林 聰，黃曉松，易艷輝，李 萍，楊 瑩，李遠(yuǎn)紅，劉柳青

湖南省腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(長(zhǎng)沙 410008)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)屬于一種慢性疾病，主要是一系列腦血管疾病因素所致的腦組織、腦循環(huán)出現(xiàn)障礙的一種智能損害綜合癥[1]，臨床表現(xiàn)主要為認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重威脅著患者的身心健康[2-3]。氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)主要是因?yàn)闄C(jī)體出現(xiàn)氧化與抗氧化失衡現(xiàn)象，導(dǎo)致?lián)p傷了組織、細(xì)胞的氧化，其在血管性癡呆發(fā)生與發(fā)展的各環(huán)節(jié)中都發(fā)揮重要作用[4-5]。B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因是一個(gè)原癌基因，可抑制神經(jīng)元凋亡和壞死，也可促進(jìn)神經(jīng)元的存活以及突觸的再生[6-7]。Bcl-2表達(dá)增加可能對(duì)腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用[8]。血管性癡呆屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“呆病”范疇，基本病機(jī)為痰蒙心神、髓海不足、血瘀痹阻及虛火上擾，屬于本虛標(biāo)實(shí)的一種疾病[9-10]。中醫(yī)治療該病，在延緩病情進(jìn)展、改善患者全身癥狀等都有一定的療效，主要治法為除濕化痰、理氣活血、補(bǔ)腎填髓、活血化痰等[11]。本文具體探討了活血化痰膠囊對(duì)血管性癡呆大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)的影響，希望為中醫(yī)臨床制定合理的治則、治法奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)成年雄性Sprague Dawley大鼠60只購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物許可證編號(hào)00010751)。4～5周齡，體重140～160 g。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度在22 ℃～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，飲食、飲水自由，12/12 h光照黑暗循環(huán)。安理申(鹽酸多奈哌齊片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20070181，規(guī)格5 mg/片)?；钛的z囊(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20100045)為當(dāng)前臨床上治療老年性癡呆的經(jīng)驗(yàn)方，由熟地、山萸肉、川斷、田七、枸杞、淫羊藿、首烏、鎖陽(yáng)等組成，膠囊3 g/粒。MT-200 Morris水迷宮購(gòu)自成都泰盟科技有限公司，抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體都購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血管性癡呆大鼠模型的建立：采用雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血再灌注法制作血管性癡呆模型，碘伏消毒大鼠頸部并固定，從大鼠頸正中縱行1.5 cm 的切口，切開(kāi)皮膚后，逐層鈍性分離皮下組織及肌肉等，暴露大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈。雙結(jié)扎手術(shù)線(xiàn)的兩側(cè)頸總動(dòng)脈近心端、遠(yuǎn)心端部位，縫合皮膚，常規(guī)抗生素預(yù)防感染。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠無(wú)明顯的肢體運(yùn)動(dòng)障礙，但是出現(xiàn)輕微的反應(yīng)遲鈍，精神萎靡。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理：將建模成功的54只大鼠(6只大鼠造模不成功的原因包括死亡、嚴(yán)重感染等)隨機(jī)分三組即模型組、西藥組與中藥組，各18只。西藥組與中藥組分別給予多奈哌齊3 g灌胃與活血化痰膠囊3 g灌胃(灌胃量為1 ml/100 g體重)，模型組以等劑量的生理鹽水代替。三組給藥時(shí)間都為21 d。大鼠灌胃時(shí)，右手持灌胃注射器，左手拇指和食中二指相對(duì)，抓住大鼠頸部皮膚，使大鼠的頭部和頸部及軀干呈一直線(xiàn)。大鼠的灌胃針長(zhǎng)8 cm，直徑1.2 mm。

2.3 觀(guān)察指標(biāo)：①在給藥后7、14、21 d進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)大鼠從入水開(kāi)始，直到跳上平臺(tái)這一段時(shí)間進(jìn)行記錄，從而確定逃避潛伏期時(shí)間，若2 min內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)則記錄為大鼠的逃避潛伏期為2 min。②在給藥后21 d處死所有大鼠，完整取出鼠腦，置于中性甲醛溶液中固定48 h并石蠟包埋，采用HE染色記錄腦組織病理變化情況。同時(shí)將其與大腦組織在玻璃勻漿器中研磨成10%勻漿，4 ℃低溫離心10 min，取上層血清，采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法測(cè)定組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)與丙二醛(Malondialdehyde，MDA)活性。③取大腦海馬組織的樣本，提取總蛋白，采用Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)標(biāo)。

結(jié) 果

1 各組大鼠逃避潛伏期比較 中藥組、西藥組給藥后7、14、21 d的逃避潛伏期都低于模型組；中藥組也低于西藥組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期比較(min)

2 各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)比較 模型組中海馬區(qū)神經(jīng)元大量變性、死亡，周?chē)霈F(xiàn)空暈，胞漿濃縮，細(xì)胞體積縮小，核固縮、碎裂明顯；西藥組中海馬區(qū)神經(jīng)元變性，神經(jīng)元胞體縮小，死亡明顯減輕，但形狀與模型組接近；中藥組中海馬區(qū)神經(jīng)元基本無(wú)變形，神經(jīng)元胞體基本正常，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰(圖1)。

圖1 各組大鼠的海馬組織形態(tài)學(xué)(HE染色，×200)

3 各組大鼠SOD與MDA活性比較 中藥組、西藥組給藥后21 d的SOD活性高于模型組，MDA活性低于模型組，相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠造模后21 d腦組織SOD與MDA活性比較

4 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 中藥組、西藥組給藥后21 d的Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于模型組，中藥組高于西藥組，相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠造模后21 d的海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

討 論

血管性癡呆是中老年人群的常見(jiàn)病、多發(fā)病，同時(shí)也給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)越來(lái)越沉重的負(fù)擔(dān)[12-14]。中醫(yī)認(rèn)為血管性癡呆的病位在腦，其本在腎，與臟腑功能失調(diào)有關(guān)，病性以瘀、火、虛、痰為主，在治療上應(yīng)以辨證與辨病相結(jié)合治療[15-16]。本研究顯示中藥組、西藥組給藥后7、14、21 d的逃避潛伏期均低于模型組，中藥組也低于西藥組。中藥組海馬區(qū)域細(xì)胞排列比較緊密，僅見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞變性、壞死，胞漿內(nèi)尼氏體比較豐富。表明活血化痰膠囊可顯著改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知水平，提高學(xué)習(xí)記憶功能，也可緩解海馬神經(jīng)元損傷[17]。

生理狀態(tài)下，機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)處于平衡狀態(tài)；當(dāng)血管性癡呆發(fā)生時(shí)，導(dǎo)致活性氧堆積[18-19]。SOD是在正常情況下存在于體內(nèi)的重要自由基天然清除劑，血管性癡呆可使得SOD活性下降，使膜結(jié)構(gòu)受損程度逐步加重。MDA是一種重要的生物大分子交聯(lián)劑，可影響DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致SOD生成減少與活性降低。本研究顯示中藥組、西藥組給藥后21 d的SOD活性高于模型組，MDA活性低于模型組，中藥組與西藥組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)前也有研究表明活血化痰膠囊可增加大鼠的下丘腦神經(jīng)元鈉鉀電流，增加海馬部位K+介導(dǎo)的乙酰膽堿釋放，從而緩解或減輕了缺血缺氧對(duì)神經(jīng)元的損傷[20-21]。還有研究表明活血化痰藥物的提取物可減輕腦缺血對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷，阻止及抑制海馬組織神經(jīng)元凋亡，從而可避免腦血管疾病患者發(fā)展成血管性癡呆[22-23]。

細(xì)胞凋亡機(jī)制中Bcl-2屬于非常重要的一種調(diào)節(jié)因子，可抑制細(xì)胞凋亡[24]。已有研究顯示雌二醇可能通過(guò)提高Bcl-2表達(dá)水平，減少海馬神經(jīng)元的凋亡，降低神經(jīng)元對(duì)凋亡刺激的敏感性，達(dá)到對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用[25-26]。本研究顯示中藥組、西藥組給藥后21 d的Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于模型組，中藥組也高于對(duì)照組，提示活血化痰膠囊可能通過(guò)提高海馬組織Bcl-2 表達(dá)，改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究也有一定的不足，活血化痰膠囊介導(dǎo)的腦神經(jīng)保護(hù)途徑比較多，本研究只分析了單一途徑；且本研究沒(méi)有設(shè)置空白對(duì)照，可能存在研究偏倚，將在后續(xù)研究中深入分析。

總之，活血化痰膠囊在血管性癡呆大鼠中的應(yīng)用能促進(jìn)海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使大鼠具有更好的學(xué)習(xí)記憶能力。