邵勁松，胡 鍇，王紅瑞，王立偉，徐 博

1 材料與方法

1.1 病例篩選條件及分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組及給藥組病例入選標(biāo)準(zhǔn) 確定性冠心病包括心肌梗死史、穩(wěn)定型心絞痛。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)組及給藥組病例排除標(biāo)準(zhǔn) ①急、慢性感染，炎癥性疾?。虎谧陨砻庖咝约膊?；③近期不穩(wěn)定型心絞痛及急性心肌梗死（3個(gè)月內(nèi)）；④風(fēng)濕性疾病近期（3個(gè)月內(nèi)）有風(fēng)濕活動(dòng)；⑤糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)或其它內(nèi)分泌疾??；⑥近期使用影響免疫反應(yīng)藥物（如皮質(zhì)類固醇）；⑦嚴(yán)重肝、腎功能不全；⑧腫瘤；⑨妊娠。

1.1.3 分組及兩組病例組成 按照是否診斷為ACVD 患者分為ACVD 組（n ＝70）和正常志愿者的Control 組（n ＝20）。 ACVD 組男性38例，女性32例，年齡46～79（68.12± 12.11）歲；Control 組男女各10例，年齡45 ～69（50.02±16.21）歲。 兩組患者基線一致（P＞0.05）。

1.2 主要儀器及試劑 CT15RE 型低溫高速離心機(jī)（Hitachi，日本），Midi 型磁力分選器（MACS，德國(guó)），25LS 型分選柱（MACS，德國(guó)），0.5 ～10、20 ～200和100～1000 μl 型移液槍（EPPendorf，德國(guó)），CD4+CD25+T cell solation kit，人 淋 巴 細(xì) 胞 分 離 液（LTS1077，Sigma），胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone），SYBR 試劑盒（Life），KCNN1.3 小鼠抗人，IRDye?800CW Goat anti-mouse（LI-COR）等。

1.3 免疫磁珠分離CD4+CD25+Tregs 收集ACVD組及Control 組的外周血5 ～10 ml，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）按照1 ∶1 的比例稀釋，將稀釋液緩緩的平鋪于1077 分離液（SIGMA）上，離心，吸取中間云狀細(xì)胞團(tuán)并充分沖洗。 使用試劑盒雙陰性分選獲得CD4+CD25+Tregs。

1.4 CD4+CD25+Tregs 的分組與培養(yǎng) 用完全培養(yǎng)基[10%胎牛血清（10 μl／ml）， rmIL-2（2.5×106IU／ml），TGF-β1（2 μg／ml）及1 %雙抗］混懸上述細(xì)胞，并均勻的種在3個(gè)10 cm 的培養(yǎng)皿（用含10 μg／ml Anti-CD3，10 μg／ml HSP60 包皿）中，將Control 組、ACVD 組和ACVD+EPL 組的CD4+CD25+Tregs 三組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，待測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證CD4+CD25+Tregs 離心收集不同組的CD4+CD25+Tregs，RPMI-1640（含胎牛血清，細(xì)胞刺激劑、離子霉素、高爾基阻斷劑）混懸細(xì)胞；留取下層細(xì)胞，濃度調(diào)整到1×106／ml；饑餓處理；分別加FITC Mouse Anti -Human CD3、APC Mouse Aniti-Human CD4、PE-CyTM7 Mouse Anti-Human CD25、PE Mouse Anti-Human CD127 各10 μl，加細(xì)胞表面抗原染色法標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)CellQuest 軟件對(duì)所有染色的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并記錄陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.6 RT-qPCR 檢測(cè)CD4+CD25+Tregs 上Kv1.3、KCa3.1、激活鈣釋放Ca2+（CRAC）通道m(xù)RNA 表達(dá)收集各組CD4+CD25+Tregs，107／ml 細(xì)胞trizol 法提取細(xì)胞總RNA， 檢測(cè)總RNA 的濃度及純度。 逆轉(zhuǎn)錄，于PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行Cycle2：（1）65℃5 min；25℃5 min；42℃60 min；70℃5 min；Cycle3（1）4℃，∞。 PCR 擴(kuò)增，于冰上配擴(kuò)增體系（H2O，6.4 μl，SYBR 10 μl，Primer 0.8 μl）加樣品1.8 μl。 設(shè)定擴(kuò)增程序Cycle1（1）50℃2 min；Cycle2（1）95℃2 min；Cycle3（40）95℃15 s，60℃15 s；Cycle4（1）60℃15 s；Cycle5（1）95℃15 s。 基因序列如表1 所示。

1.7 ICW 檢測(cè)CD4+CD25+Tregs 蛋白的表達(dá) 收集各組CD4+CD25+Tregs 用上述1640 培養(yǎng)基混懸，分別布于U 型黑壁96 孔板中，37 ℃，5%的培養(yǎng)箱放置10 min；待細(xì)胞靜置于底部后固定，于室溫30 r／min搖床30 min；去上清，重新加入封閉液，輕搖；孵育一抗（KCNN1.3 小鼠抗人，ab105522）于4 ℃輕搖過(guò)夜；孵育二抗，避光輕搖1 h，于Odyssey 雙紅外激光檢測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)，中等掃描質(zhì)量，調(diào)整分辨率、焦距及亮度，分別為169 μm、3.0 mm、5。

表1 基因序列

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)使用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用單因素方差分析，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 流式檢測(cè)CD4+CD25+Tregs 的純度 三組CD4+CD25+Tregs 的純度均超過(guò)80 %故具有研究代表性，且三組不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 流式結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 流式檢測(cè)CD4+CD25+Tregs 的純度（n＝20）

2.2 CCK-8 法檢測(cè)EPL 的最佳濃度 CD4+CD25+Tregs 給藥孵育48 h 后給予CCK-8 試劑孵育（37℃，5%CO2）4 h 于紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)，得到下圖的曲線，如圖2 所示，0、0.3、1、3、10、30、100 μmol 的EPL 對(duì)CD4+CD25+Tregs CCK-8 染色的OD 值抑制率曲線，n ＝1，2，3……30 μmol 的EPL 大約抑制CD4+CD25+Tregs 增殖達(dá)53.26%，故30 μmol EPL 為最佳濃度。

2.3 RT-qPCR 檢測(cè)各組CD4+CD25+Tregs Kv1.3、KCa3.1 和CRAC 通道的mRNA 表達(dá) ACVD 組的Kv1.3、KCa3.1、CRAC 通道的mRNA 表達(dá)是Control組3.35、2.18、2.22 倍（P＜0.01）， ACVD+EPL 組是ACVD 組的三組離子通道的mRNA 表達(dá)62.09%、61.01%、76.68%（P＜0.01）。 將Control 組結(jié)果標(biāo)化，ACVD 組與Control 組比較主要觀察AS 性心血管疾病患者的CD4+CD25+Tregs 上Kv1.3、KCa3.1、CRAC 通道m(xù)RNA 表達(dá)，以及EPL 培養(yǎng)后各基因的相對(duì)表達(dá)。 見(jiàn)圖3。

圖2 不同濃度EPL 對(duì)CD4+CD25+ Tregs 增殖的抑制率

圖3 CD4+CD25+Tregs 上相關(guān)離子通道的mRNA 表達(dá)

2.4 In-cell western blotting 檢測(cè)CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表達(dá) ACVD 者的CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表達(dá)是正常人CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表達(dá)的1.83 倍（P＜0.01）。ACVD 外周血中的CD4+CD25+Tregs 給予EPL 后，Kv1.3 通道蛋白的表達(dá)下降了26.19%（P＜0.01）。見(jiàn)圖4 。

圖4 CD4+CD25+Tregs Kv1.3 通道蛋白的表達(dá)

3 討 論

AS 是由脂質(zhì)代謝障礙引起的慢性炎癥性疾病，動(dòng)脈管壁失去彈性形成斑塊或破裂，心功能降低，即為ACVD[8］。 有研究發(fā)現(xiàn)，粥樣斑塊的形成與病理狀態(tài)下的免疫細(xì)胞激活和動(dòng)脈管壁釋放的炎性因子相互作用的結(jié)果[9］。 ACVD 是2013年提出的一個(gè)新概念，其中危害人類最嚴(yán)重的是各種常見(jiàn)的ACVD[10］。在炎癥反應(yīng)中，免疫系統(tǒng)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS）過(guò)度激活是也是導(dǎo)致AS 的重要原因，故血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors， ACEI）類及β-受體阻滯劑被經(jīng)典用于預(yù)防和逆轉(zhuǎn)ACVD，大量研究表明ALD 通過(guò)其RAAS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AS 引起的心功能衰弱的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11］。 ACEI 類及β-受體阻滯劑可減少ALD 在AS 時(shí)的釋放，EPL 是第二代ALD 受體拮抗劑，具有選擇性高，毒副作用小的優(yōu)勢(shì)。

ACVD 炎癥學(xué)說(shuō)被廣泛的認(rèn)可，在炎癥反應(yīng)中，免疫細(xì)胞被激活，產(chǎn)生的炎性介質(zhì)進(jìn)一步促進(jìn)了AS的發(fā)展和惡化[12］。 T 淋巴細(xì)胞作用下的細(xì)胞免疫被激活，其調(diào)控模式為： 活化后的T 淋巴細(xì)胞，CRAC通道打開(kāi)，Ca2+內(nèi)流顯著增加導(dǎo)致鈣依賴性的蛋白激酶通路進(jìn)行各種細(xì)胞因子合成[13］。 鈣離子激活，使T 細(xì)胞處于能被活化的狀態(tài)[14］。 選擇性抑制Kv1.3 通道會(huì)抑制Tregs 的活化及其對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌[15］。 由于Kv1.3 通道是T 淋巴細(xì)胞上的主要作用通道，因此Kv1.3 通道是免疫炎癥疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵離子通道[16］。

ACVD 外周血中的CD4+CD25+Tregs 的Kv1.3、KCa3.1 及CRAC 通道的mRNA 的表達(dá)均較正常組顯著增加，給予30 μmol EPL 后，其表達(dá)均被顯著抑制，其中Kv1.3 通道抑制最為明顯，并且在對(duì)Kv1.3 通道蛋白質(zhì)進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)ACVD 組的Kv1.3 蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著增加，EPL 可顯著抑制其表達(dá)（P＜0.01）。

綜上所述，Kv1.3 等通道可調(diào)控ACVD 外周血CD4+CD25+Tregs 的活化，而ALD 受體拮抗劑EPL對(duì)ACVD 外周血CD4+CD25+Tregs 上的Kv1.3 通道具有顯著的抑制作用，這一現(xiàn)象對(duì)揭示Kv1.3 通道與ALD 受體的關(guān)系具有重要意義。 Kv1.3 通道對(duì)ALD 抑制作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究，這對(duì)臨床ACVD 的治療提供了新的研究思路和治療方向，T 淋巴細(xì)胞膜上的Kv1.3 通道在炎癥疾病的治療和靶向地位作用值得深入探究。