陳柯源， 宋向東， 程 峰， 張玉珺， 梁劍平， 郝寶成

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730050)

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，減抗(減少使用抗生素)、限抗(限制使用抗生素)的呼聲日益高漲，中藥飼料添加劑將是畜禽養(yǎng)殖業(yè)未來發(fā)展的選擇。中藥具有抗菌、增強(qiáng)免疫等多種生物活性，作為畜禽飼料添加劑已被廣泛使用。當(dāng)歸補(bǔ)血湯(Danggui buxue tang，DBT)是一種傳統(tǒng)的中藥復(fù)方，由黃芪和當(dāng)歸組成，干質(zhì)量比例為1∶5[1]，藥理學(xué)研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有促進(jìn)造血功能，刺激心血管循環(huán)，增加抗氧化及免疫活性的能力[1-8]。然而與中藥相比，益生菌發(fā)酵中藥具有毒副作用小、無抗藥性、功能多樣等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體有著更為顯著的積極作用。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，發(fā)酵中藥可顯著提高肉雞日增質(zhì)量，降低料肉比并對(duì)機(jī)體相關(guān)免疫指標(biāo)起到明顯的積極調(diào)控作用[9-11]。因此，研究和開發(fā)新型的綠色、無公害飼料添加劑已成當(dāng)前的必然發(fā)展趨勢(shì)。DBT作為經(jīng)典中藥復(fù)方，雖然在前期研究中發(fā)現(xiàn)其具有一定的促生長和提高免疫功能等作用，但效果并不顯著，不能完全發(fā)揮DBT中藥復(fù)方中有效成分的活性作用，且缺乏發(fā)酵DBT對(duì)肉雞生長性能、免疫功能及抗氧化能力影響的系統(tǒng)研究。本研究擬采用枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵DBT的方式制備DBT發(fā)酵產(chǎn)物，通過42 d的飼喂試驗(yàn)和相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，深入探討并系統(tǒng)研究DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、免疫功能、抗氧化能力及十二指腸絨毛形態(tài)的影響，為DBT發(fā)酵產(chǎn)物用作新型飼料添加劑提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；新城疫(Lasota株)、傳染性法氏囊疫苗購自哈藥集團(tuán)有限公司。黃芪、當(dāng)歸均購自甘肅復(fù)興厚生物醫(yī)藥科技有限公司；雞IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α等試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：SBE221910)；血清GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(生產(chǎn)批號(hào)：20190526)。

1.2 DBT藥粉及發(fā)酵產(chǎn)物的制備

DBT藥粉制備：將黃芪和當(dāng)歸洗凈烘干后，按5∶1的質(zhì)量比準(zhǔn)確稱取2種藥材混合粉碎，并過60目篩。DBT發(fā)酵產(chǎn)物制備：無菌條件下，取-70 ℃下保存的枯草芽孢桿菌接種于血平板上，于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于5 ml LB肉湯中，在37 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)15 h，以2%的體積分?jǐn)?shù)接種于100 ml LB肉湯中，相同條件下傳代培養(yǎng)得到種子液。以2.92%的體積分?jǐn)?shù)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(0.95%無水葡萄糖，1.52%蛋白胨，0.30%酵母浸出粉，0.05%磷酸氫二鉀，0.07%無水硫酸鎂，0.02%碳酸鈣，6.00% DBT藥粉，100 ml去離子水，初始pH為7.2)中，在37 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)35.8 h，冷凍干燥后得到DBT發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)約為6.8×108CFU/g)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

試驗(yàn)動(dòng)物為210只1日齡體質(zhì)量相近、健康的白羽肉雞，隨機(jī)分成5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)7只雞，A1為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，A2為DBT未發(fā)酵組，在基礎(chǔ)日糧中添加1.0%的DBT藥粉, A3、A4、A5為DBT發(fā)酵組，在日糧中分別添加0.5%、1.0%、2.0%的DBT發(fā)酵產(chǎn)物。試驗(yàn)期為42 d，1～21 d為試驗(yàn)前期，22～42 d為試驗(yàn)后期。

試驗(yàn)飼糧采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，根據(jù)中國雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)營養(yǎng)需要量進(jìn)行飼糧配制，組成及營養(yǎng)水平見表 1。每個(gè)平養(yǎng)籠中飼養(yǎng)7只肉雞，試驗(yàn)期間所有肉雞飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，環(huán)境溫度從36 ℃逐漸降至22 ℃，自由采食和飲水，24 h光照，并按常規(guī)免疫程序進(jìn)行疫苗接種。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1 生長性能測(cè)定 分別在肉雞21日齡和42日齡，禁食12 h，對(duì)每個(gè)重復(fù)的供試肉雞稱質(zhì)量，并詳細(xì)記錄各個(gè)階段的飼料消耗量，計(jì)算2個(gè)階段肉雞的平均日增質(zhì)量(ADG)、平均日采食量(ADFI)以及料肉比(F/G)。

1.4.2 樣品采集 分別在肉雞21日齡和42日齡，禁食12 h，從每個(gè)重復(fù)的供試肉雞中隨機(jī)抽取2只，心臟采血10 ml，于4 ℃過夜，然后3 000 r/min離心10 min，分離血清于-80 ℃中保存，待測(cè)。

1.4.3 免疫器官臟器指數(shù)測(cè)定 分別在肉雞21日齡和42日齡，心臟采血后放血處死，剖檢，采集脾臟、法氏囊并稱質(zhì)量，臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

1.4.4 十二指腸絨毛形態(tài)觀察 分別在肉雞21日齡和42日齡，心臟采血后放血處死，剖檢，在十二指腸的中間部位截取約2～3 cm，迅速浸入生理鹽水中漂洗內(nèi)容物，然后置于10%甲醛固定液中，將固定的標(biāo)本經(jīng)水洗、脫水、透明等步驟處理，再用石蠟包埋，冷卻凝固后，制作厚度5 μm的切片，蘇木精伊紅染色，樹脂封片。在石蠟切片中選出典型視野，采用生物顯微鏡及顯微圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量腸絨毛高度(V)和隱窩深度(C)，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度比(V/C)。

1.4.5 新城疫抗體效價(jià)測(cè)定 用新城疫疫苗在7 d和21 d時(shí)對(duì)各組肉雞進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻免疫接種，采用半微量血凝抑制實(shí)驗(yàn)法測(cè)定HI抗體效價(jià)。

1.4.6 細(xì)胞因子測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清白細(xì)胞介素2 (IL-2)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素(INF-γ)含量，詳細(xì)步驟參考試劑盒說明書。

1.4.7 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 參照試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS23. 0軟件進(jìn)行單因素(One-way ANOVA)方差分析，并采用LSD法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異顯著水平，數(shù)據(jù)分析結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，在生長前期和整個(gè)試驗(yàn)期(1～21 d和1～42 d)中，各試驗(yàn)組肉雞(A2～A5)的日增質(zhì)量與對(duì)照組相比無顯著差異，但A4和A5處理的日采食量與A2處理和對(duì)照組相比顯著減少(P<0.05)，并且從整個(gè)試驗(yàn)期來看，DBT發(fā)酵組的料肉比顯著低于A2處理和對(duì)照組(P<0.05)。而在試驗(yàn)后期(22～42 d)，各試驗(yàn)組(A2～A5)肉雞日增質(zhì)量均有顯著提高(P<0.05)，其中，A4和A5處理最為顯著(P<0.05)，但兩組之間無顯著差異，同時(shí)，試驗(yàn)組A2～A5的日采食量、料肉比與對(duì)照組相比均顯著減少(P<0.05)，其中，A4和A5處理的料肉比與A2處理相比顯著降低(P<0.05)，各試驗(yàn)組之間日采食量差異不顯著。

表2 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞生長性能的影響

2.2 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表3可知，在21 d時(shí)，A4處理與A2相比脾臟指數(shù)顯著增加 (P<0.05)，其他各組之間差異不顯著。A3～A5處理的法氏囊指數(shù)與對(duì)照組和A2處理相比具有顯著差異(P<0.05)，A2處理與對(duì)照組差異不顯著。

在42 d時(shí)，A3～A5處理的脾臟指數(shù)與對(duì)照組和A2處理相比具有顯著差異(P<0.05)，A3～A5處理之間以及對(duì)照組與A2處理之間差異不顯著(P>0.05)。A4和A5處理的法氏囊指數(shù)與其他3組相比均顯著增加(P<0.05)，但A4處理與A5處理間無顯著差異，A3處理和A2處理與對(duì)照組相比差異也不顯著。

表3 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞血清新城疫抗體效價(jià)的影響

由圖1可知，在21 d和42 d，A4和A5處理的抗體效價(jià)均比其他3組有顯著提高(P<0.05)，且A5處理高于A4。A2處理與A3處理與對(duì)照組相比較在21 d時(shí)均有一定水平提高(P<0.05)，但在42 d時(shí)差異不顯著。

2.4 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞血清細(xì)胞因子的影響

由圖2可知，在21 d和42 d時(shí)，與A2處理和對(duì)照組相比，DBT發(fā)酵組對(duì)于肉雞血清中各個(gè)細(xì)胞因子的影響具有顯著差異，其中， A4處理和A5處理影響較為突出(P<0.05)，但處理之間差異不顯著。從整體上看，A4處理可顯著影響血清中4種細(xì)胞因子含量，與對(duì)照組相比，在21 d時(shí)，A4和A5處理可使血清中IL-2(圖2A)、IL-6(圖2B)、TNF-α(圖2C)、INF-γ(圖2D)含量得到顯著提高(P<0.05)。A2處理與對(duì)照組相比，IL-2含量顯著增加(P<0.05)，其他3個(gè)指標(biāo)均無顯著差異。在42 d時(shí)，與對(duì)照組相比，A4處理血清中IL-2、IL-6含量顯著降低(P<0.05)，而TNF-α、INF-γ含量則顯著提高(P<0.05)。與對(duì)照組相比，A2處理在IL-2、IL-6含量上差異不顯著，但在TNF-α、INF-γ含量上顯著提高(P<0.05)。

A1、A2、A3、A4、A5見表2注；不同小寫字母表示同一時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞血清新城疫抗體效價(jià)的影響Fig.1 Effects of DBT fermentation products on ND-HI immune globulin of serum in broilers

A1、A2、A3、A4、A5見表2注；不同小寫字母表示同一時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。圖2 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞血清細(xì)胞因子的影響Fig.2 Effects of DBT fermentation products on cytokine of serum in broilers

2.5 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由圖3可知，在21 d時(shí)，各組之間的超氧化物歧化酶及總抗氧化能力無顯著性差異(P>0.05)，與對(duì)照組相比， A3、A4、A5處理谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性均顯著提高(P<0.05)，但各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。A4處理和A5處理與其他3組相比較，血清中丙二醛含量顯著降低(P<0.05)，但A4、A5處理之間以及其他3組之間差異不顯著。在42 d時(shí)，與A2處理和對(duì)照組相比，A4處理和A5處理肉雞血清中各抗氧化指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，但A4處理和A5處理之間差異不顯著。

2.6 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞十二指腸絨毛形態(tài)的影響

由表4可知，在21 d，與對(duì)照組和A2處理相比較，A4處理和A5處理的肉雞十二指腸絨毛高度有所增加，且隱窩深度相對(duì)降低，同時(shí)，絨毛高度與隱窩深度比值增加，此外，A4處理和A5處理與對(duì)照組相比，各指標(biāo)也表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，但各組之間無顯著差異(P>0.05)。

在42 d，各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，絨毛高度都有所增加，且DBT發(fā)酵組高于DBT未發(fā)酵組，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。各試驗(yàn)組的隱窩深度與對(duì)照組相比都有所減少，A4處理的絨毛高度與隱窩深度比值與對(duì)照組和A2處理相比均顯著提高 (P<0.05)。

A1、A2、A3、A4、A5見表2注；不同小寫字母表示同一時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。圖3 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞血清抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of DBT fermentation products on serum antioxidant capacity of broilers

表4 DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞十二指腸絨毛形態(tài)的影響

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，日糧基礎(chǔ)飼料中添加1.0%的DBT發(fā)酵產(chǎn)物(A4處理)可有助于提高肉雞的日增質(zhì)量，降低料肉比和日采食量，并顯著改善動(dòng)物的免疫功能和抗氧化能力，同時(shí)對(duì)十二指腸絨毛形態(tài)的完整性也起到了保護(hù)作用，且效果優(yōu)于DBT未發(fā)酵組。

益生菌發(fā)酵中藥技術(shù)極大促進(jìn)了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。傳統(tǒng)中藥可顯著提高肉雞的生長性能[12]，而發(fā)酵中藥使中藥藥效在動(dòng)物體內(nèi)得到了更好的發(fā)揮。相關(guān)研究報(bào)道顯示，張曉靜等通過在日糧中添加發(fā)酵黃芪-甘草水提物或黃芪發(fā)酵產(chǎn)物，可使肉雞的日增質(zhì)量和料肉比都分別顯著升高和降低，且發(fā)酵中藥的效果優(yōu)于未發(fā)酵中藥[13-14]。本研究結(jié)果表明，發(fā)酵DBT可顯著增加肉雞日增質(zhì)量，減少日采食量并降低料肉比，同時(shí)DBT發(fā)酵組的作用效果要優(yōu)于DBT未發(fā)酵組，這與上述研究報(bào)道一致。這可能是由于中藥發(fā)酵后有效成分含量增加，從而藥效增強(qiáng)。同時(shí)，本試驗(yàn)中所采用的枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許作為飼料添加劑的益生菌菌種之一，其廣譜的抗菌活性以及平衡腸道菌群的作用，可顯著提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[15-16]。因此，DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞的生長有顯著的促進(jìn)作用。

良好的免疫性能可平衡體內(nèi)免疫相關(guān)活性物質(zhì)的分泌，從而有效抵抗外界致病菌。IL-2和IL-6可分別通過細(xì)胞和體液免疫的調(diào)節(jié)來促進(jìn)免疫球蛋白和抗體的產(chǎn)生[17-19]。IFN-γ可通過激活巨噬細(xì)胞達(dá)到促進(jìn)對(duì)病原體的吞噬及殺傷的作用，同時(shí)還可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。TNF-α可對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和單核巨噬細(xì)胞的活化起到調(diào)控作用，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒功效[20-21]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，肉雞經(jīng)飼喂中藥發(fā)酵產(chǎn)物后，其脾臟、法氏囊指數(shù)、ND抗體效價(jià)以及血清中IgG和IL-2含量等免疫性能指標(biāo)與未發(fā)酵組相比均有顯著提高[22-23]。作為禽類最重要的免疫器官，脾臟和法氏囊對(duì)體內(nèi)免疫活性物質(zhì)的產(chǎn)生起著重要作用。本研究中，1.0% DBT發(fā)酵組與DBT未發(fā)酵組和對(duì)照組相比，ND抗體效價(jià)、各細(xì)胞因子水平及免疫器官指數(shù)在21 d時(shí)均顯著增加。這可能與發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量的增加有關(guān)[24]，因?yàn)槎嗵蔷哂锌鼓[瘤和刺激機(jī)體免疫等功能，使免疫指標(biāo)水平得到顯著提高，此外，IL-2和IL-6作為促炎因子，若長期在體內(nèi)維持高水平表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致相關(guān)免疫細(xì)胞消耗大量物質(zhì)和能量來平衡免疫應(yīng)答[25]。本研究結(jié)果顯示，在42 d時(shí)，DBT發(fā)酵組IL-2和IL-6的含量與其他組相比明顯下降，而其他免疫指標(biāo)則顯著升高，說明1.0%的DBT發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肉雞免疫性能具有良好的調(diào)節(jié)作用。

T-AOC、MDA、GSH-Px和SOD是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[26]。T-AOC可反映機(jī)體對(duì)外界刺激的代償能力和機(jī)體自由基代謝狀態(tài)，MDA含量與細(xì)胞的氧化損傷程度有關(guān)[27-28]，GSH-Px和SOD可分別清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的多余脂質(zhì)過氧化物和超氧陰離子自由基，從而使細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常水平。多項(xiàng)研究報(bào)道顯示，發(fā)酵中藥可對(duì)肉雞抗氧化性能起到顯著的改善作用，安勝英等[29]發(fā)現(xiàn)0.5%的中藥復(fù)方發(fā)酵產(chǎn)物可使仔雞血漿中GSH-Px的活性顯著升高，同時(shí)明顯降低了腿肌MDA含量。此外，給肉雞飼喂1%的補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑也可使其血清和肝臟中的T-SOD、GSH-Px活性等抗氧化指標(biāo)得到顯著改善，且功效優(yōu)于未發(fā)酵組[30]。本研究結(jié)果顯示，1.0%的DBT發(fā)酵產(chǎn)物可顯著增加肉雞血清中T-AOC能力和GSH-Px、SOD活性，同時(shí)使血清MDA含量明顯下降，這與上述研究報(bào)道相一致。DBT中含有黃芪多糖、黃芪甲苷、阿魏酸等多種抗氧化成分，但在本試驗(yàn)中，DBT未發(fā)酵組對(duì)肉雞的抗氧化指標(biāo)并未起到十分顯著的影響，推測(cè)可能由于本試驗(yàn)肉雞品種對(duì)DBT藥物敏感度較低所致，而DBT與枯草芽孢桿菌互作后，菌種的次級(jí)代謝產(chǎn)物可能與DBT的活性成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，合成新的抗氧化成分，從而對(duì)肉雞的抗氧化性能的提高起到促進(jìn)作用。

小腸絨毛形態(tài)間接反映了機(jī)體的生長發(fā)育狀況，小腸絨毛高度和隱窩深度是評(píng)價(jià)動(dòng)物消化吸收能力的重要指標(biāo)，腸絨毛V/C值的高低與腸道凈吸收量呈正相關(guān)[31-32]。前人研究報(bào)道指出，發(fā)酵芪楂口服液藥渣使仔豬空腸、回腸絨毛高度和V/C值明顯大于未發(fā)酵組，且絨毛寬度和隱窩深度小于未發(fā)酵組[33]，這說明發(fā)酵中藥對(duì)小腸絨毛形態(tài)有良好的改善作用。此外，益生菌對(duì)于維持腸絨毛形態(tài)的完整性也有顯著影響。有研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌E-8可對(duì)大腸桿菌性腹瀉有顯著的治療效果，并對(duì)肉雞小腸絨毛形態(tài)起到良好的修復(fù)作用[34]。本試驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種得到DBT發(fā)酵產(chǎn)物，與對(duì)照組和未發(fā)酵組相比，1.0% DBT發(fā)酵組可對(duì)小腸絨毛形態(tài)起到明顯的改善作用，與上述研究報(bào)道相一致。

本研究中所用DBT經(jīng)益生菌發(fā)酵后，DBT的有效活性成分種類及含量可能發(fā)生了某些改變，鑒于本次試驗(yàn)條件的局限性，僅對(duì)中藥發(fā)酵產(chǎn)物的使用效果進(jìn)行了研究，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。