吳 嬌， 張世青， 張鳳龍， 高景林， 趙冬香， 趙 珊， 韓文素， 鐘義海， 王釋婕

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101； 2.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 海口 570000； 3.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570000； 4.云南蜂弘生物科技有限公司，云南 昆明 650000)

無刺蜂蜂膠是由無刺蜂工蜂采集多種植物樹脂，與蠟腺分泌物以及泥土等混合加工而成的膠狀固形物，主要用于筑巢、填補(bǔ)蜂箱縫隙以及防御天敵等[1]。無刺蜂蜂膠具有豐富的藥理學(xué)活性，在抑菌、抗癌[2]、抗氧化[3]及抗炎[4]等方面的效果最為顯著，此外還具有護(hù)胃、護(hù)肝及防治病蟲害等作用[5]。

蜂膠的成分復(fù)雜，具有多種生物學(xué)活性，不同提取方法對于蜂膠的活性成分和生物學(xué)功能有很大影響。以往大多數(shù)研究主要關(guān)注西方蜜蜂(Apismellifera)蜂膠醇提物或水提物的活性[6-8]，而研究結(jié)果表明，蜂膠的乙酸乙酯提取物不僅對溫度和溶液的酸堿性有很好的穩(wěn)定性[9]，還對柑橘青霉病和綠霉病有顯著的抑制作用[10]。

目前國內(nèi)外主要針對Meliponasubnitida[11]、Scaptotrigonapostica[12]以及馬來西亞無刺蜂(Heterotrigonaitama)[13]等無刺蜂蜂膠的化學(xué)成分及抗氧化性進(jìn)行研究，而中國無刺蜂蜂產(chǎn)品研究尚處于起步階段。鑒于此，本研究以中國戈氏無刺蜂[Tetragonulagressitti(Sakagami) ]和黃紋無刺蜂[Lepidotrigonaflavibasis(Cockerell) ]蜂膠為研究對象，采用乙酸乙酯按不同料液比提取蜂膠，比較提取率最高的蜂膠提取物中總酚含量及抗氧化效果，以期為中國無刺蜂蜂膠作為天然抗氧化劑提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用的戈氏無刺蜂和黃紋無刺蜂蜂膠均采自云南昆明。乙酸乙酯、無水碳酸鈉、甲醇、抗壞血酸購自西隴科學(xué)股份有限公司，沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH )購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司，蘆丁購自源葉生物科技有限公司，F(xiàn)olin-Ciocalteu購自Sigma-Aldrich Corporation of the USA。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)(SB-5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品)、渦旋儀(VORTEX-J，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品)、離心機(jī)(德國艾本德公司產(chǎn)品)、冰箱(BCD-532WDPT，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品)、電子天平(ME403E/02，梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品)、pH計(jì)(FE28，梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品)、循環(huán)水式真空泵(鞏義市英裕予華儀器廠產(chǎn)品)、低溫冷卻液循環(huán)泵(DL-2005，上海啟前電子科技有限公司產(chǎn)品)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國制造)、酶標(biāo)儀(INFINITE 200 PRO，奧地利托肯有限公司產(chǎn)品)、純水儀(PF09771，法國制造)、研磨儀(MM 400, Retsch公司產(chǎn)品)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無刺蜂蜂膠提取物的制備 用超純水將無刺蜂蜂膠清洗2～3遍去除雜質(zhì)，晾干后放入-20 ℃冰箱冷凍。將冷凍后的蜂膠切碎，再用液氮將其研磨成粉狀。稱取無刺蜂蜂膠粉末4 g，按照蜂膠∶乙酸乙酯(質(zhì)量體積比)1.0∶10.0、1.0∶5.0、1.0∶2.5(g/ml)加入相應(yīng)體積的乙酸乙酯浸提24 h，分別制成不同料液比的提取物，浸提期間不定時(shí)搖晃，輔助超聲30 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液濃縮，濃縮后的蜂膠提取物干燥后保存在冰箱中備用。提取率計(jì)算公式：

無刺蜂蜂膠提取率=(干燥后總質(zhì)量-容器質(zhì)量)/無刺蜂蜂膠初始質(zhì)量×100%

1.3.2 pH的測定 不同料液比無刺蜂蜂膠提取液的pH，用pH試紙(量程為0.5～5.0)和pH計(jì)進(jìn)行測定并記錄。

1.3.3 總酚含量的測定 參考Folin-Ciocalteu法[14]測定無刺蜂蜂膠提取物中的總酚含量。選取提取率最高的2種無刺蜂蜂膠提取物，以沒食子酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定其總酚含量。配制1 000 μg/ml的蜂膠提取物甲醇溶液和1 000 μg/ml的沒食子酸甲醇溶液，將沒食子酸甲醇溶液稀釋成100.00 μg/ml、50.00 μg/ml、25.00 μg/ml、12.50 μg/ml和6.25 μg/ml質(zhì)量濃度梯度。分別取上述濃度沒食子酸甲醇溶液和蜂膠提取物甲醇溶液各0.2 ml，加入0.5 ml Folin-Ciocalteu溶液和2.0 ml 37.5%碳酸鈉，用超純水定容至5.0 ml，充分混勻并避光靜置30 min。每個(gè)處理取0.2 ml加入96孔板，在760 nm處測量吸光度，以甲醇溶液作為空白對照，總酚含量以樣品中沒食子酸當(dāng)量質(zhì)量(mg/g， GAE)表示。

1.3.4 抗氧化性的測定 參考Sobrinho等[15]的方法，用DPPH 法測定無刺蜂蜂膠抗氧化性。選取提取率最高的2種無刺蜂蜂膠提取物配制成1 000 μg/ml提取物甲醇溶液，分別取10 μl、20 μl、40 μl、80 μl、160 μl提取物甲醇溶液，用DPPH 甲醇溶液(40 μg/ml)定容至1 ml，樣品質(zhì)量濃度分別為10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml、160 μg/ml，搖勻并避光靜置30 min。以甲醇溶液作為空白對照，以DPPH 甲醇溶液作為陰性對照，在517 nm處測定吸光度。計(jì)算抗氧化性及半清除率質(zhì)量濃度(IC50)。

抗氧化性計(jì)算公式：

AA=ABScn-(ABSsample-ABSblank)/ABScn×100%

其中，AA為抗氧化活性的百分比；ABScn為陰性對照的吸光度；ABSsample為樣品的吸光度；ABSblank為空白對照的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理平行測定3次，采用SPSS 20軟件方差分析(ANOVA)中的Duncan’s多重比較進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism 7軟件計(jì)算IC50。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取率

不同料液比無刺蜂蜂膠與乙酸乙酯所得到的提取物得率差別很大(表1)。戈氏無刺蜂蜂膠與乙酸乙酯料液比為1.0∶5.0(g/ml)時(shí)提取率最高，為47.68%±1.26%，其次是當(dāng)料液比為1.0∶10.0(g/ml)時(shí)，提取率為46.45%±2.37%，且2種料液比的提取率極顯著高于料液比為1.0∶2.5(g/ml)的提取率(P<0.01)。黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯的提取率最高為43.12%±3.64%，最低為29.26%±0.68%，且按料液比1.0∶10.0(g/ml)和1.0∶5.0(g/ml)所得到的提取率均極顯著高于料液比1.0∶2.5(g/ml)得到的提取率(P<0.01)。戈氏無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的pH范圍為3.17～3.58，黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的pH范圍則為2.25～2.75。當(dāng)戈氏無刺蜂蜂膠和黃紋無刺蜂蜂膠與乙酸乙酯料液比為1.0∶5.0(g/ml)時(shí)提取率最高，故采用料液比為1.0∶5.0(g/ml)的無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 戈氏無刺蜂蜂膠和黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取率及提取液pH的比較

2.2 兩種無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物中總酚含量

根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.007 7+0.003 4x，R2=0.999 6)(圖1)，計(jì)算得到戈氏無刺蜂蜂膠和黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的總酚含量(圖2)，結(jié)果表明黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物中總酚含量[(58.94±1.04) mg/g, GAE]極顯著高于戈氏無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物中總酚含量[(47.91±0.36) mg/g, GAE](P<0.01)。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

**表示差異極顯著(P<0.01)。圖2 2種無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物總酚含量的比較Fig.2 Comparison on total phenols content of ethyl acetate extracts from two stingless bee geopropolis

2.3 兩種無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的抗氧化性

由圖3可知，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為10～160 μg/ml，2種無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物對DPPH自由基均有一定的清除能力，且DPPH自由基清除率隨提取物濃度的增加而升高。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到80 μg/ml時(shí)，變化趨于平緩。低數(shù)值的IC50對應(yīng)高抗氧化活性,戈氏無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的抗氧化性IC50高于黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的抗氧化性IC50，表明黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的抗氧化性高于戈氏無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物(表2)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 2種無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力Fig.3 DPPH free radical scavenging capacity of ethyl acetate extracts from two stingless bee geopropolis

3 討 論

采用溶劑浸提法提取蜂膠是根據(jù)所選用浸提溶劑的極性與目標(biāo)成分的極性相似相溶的原理，不同溶劑因極性不同，浸提得到的目標(biāo)成分及含量存在差異[16]。本研究結(jié)果表明，戈氏無刺蜂蜂膠和黃紋無刺蜂蜂膠與乙酸乙酯料液比為1.0∶5.0 (g/ml)時(shí)提取率均為最高，其次是當(dāng)料液比為1.0∶10.0 (g/ml)時(shí)的提取率。無刺蜂蜂膠提取率發(fā)生變化的原因除了與蜂膠本身特性有關(guān)外，跟溶劑極性及其體積也有很大關(guān)系，因此提取出來的物質(zhì)也會(huì)有差異。

表2 2種無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物清除DPPH 自由基的IC50

自由基是人體組織中有氧代謝過程中的產(chǎn)物，對機(jī)體組織有一定損害甚至?xí)?dǎo)致脂質(zhì)過氧化、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病等的產(chǎn)生[17]。本研究結(jié)果表明，戈氏無刺蜂蜂膠和黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物對DPPH自由基均有一定的清除能力，DPPH自由基清除率隨提取物質(zhì)量濃度的增加而升高，且黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物的抗氧化性高于戈氏無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物，這與M.subnitida蜂膠乙酸乙酯提取物抗氧化活性最強(qiáng)的結(jié)果相一致[11]。也有大量研究結(jié)果表明，S.postica[12]、S.depilis和M.quadrifasciataanthidioides[18]等無刺蜂蜂膠均有清除DPPH自由基的作用。此外，黃紋無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物中總酚含量極顯著高于戈氏無刺蜂蜂膠乙酸乙酯提取物，但是其總酚含量遠(yuǎn)低于Araújo等[19]的測定結(jié)果，這可能與蜂膠來源、成分差異或者蜂膠的提取和測定方法有關(guān)。本研究中，蜂膠總酚含量與抗氧化性呈正相關(guān)，這一結(jié)論與Pazin等[20]證明巴西無刺蜂蜂膠酚酸含量與抗氧化活性相關(guān)的結(jié)果相一致。