李嬌　阮志國(guó)　李江　付鵬 李曉梅 榮慧瑩 侯安國(guó)

【摘 要】 目的：檢測(cè)SD大鼠單用姜黃素及姜黃素聯(lián)合柴胡給藥后體內(nèi)各組織中的姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，研究柴胡對(duì)姜黃素在大鼠體內(nèi)組織分布的影響。方法：將大鼠分為姜黃素組（500 mg/kg），姜黃素與柴胡低、中、高劑量（0.51 mg/kg、1.02 mg/kg、2.04 mg/kg）聯(lián)合組。大鼠灌胃給藥后，利用HPLC測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物各組織中的姜黃素質(zhì)量濃度，以峰濃度比（Ce）、總靶向系數(shù)（Te）、藥物分布效率（Rte）和相對(duì)攝取率（Re）來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)合給藥后姜黃素在動(dòng)物體內(nèi)分布的靶向性特征及變化。結(jié)果：與單用姜黃素組相比，低、中劑量的柴胡與姜黃素合用可增加姜黃素在肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟的分布，而高劑量組除脾臟外，其它臟器的藥物分布均減少。結(jié)論：與單用姜黃素相比，姜黃素與低、中劑量柴胡聯(lián)用對(duì)組織分布影響顯著，柴胡對(duì)姜黃素在大鼠體內(nèi)具有引藥入肝的作用。

【關(guān)鍵詞】 引經(jīng)藥;柴胡;姜黃素;組織分布

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2020）14-0001-07

Effects of Bupleurum Chinense as an Medicinal Guides on Distribution of Curcumin in Rats

LI jiao1 RUAN Zhiguo1 LI jian1 FU Peng1 LI Xiaomei1 RONG Huiying1 HOU Anguo1，2*

1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China;

2.Yunnan Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology Research，Kunming? 650500，China

Abstract：[WTHZ]Objective[WTBZ] To detect the curcumin mass fractions in tissues of SD rats treated with curcumin alone and curcumin combined with Bupleurum， and to study the effect of Bupleurum on tissue distribution of curcumin in rats.[WTHZ]Methods[WTBZ] Rats were divided into curcumin group （500 mg/kg）， curcumin and Bupleurum low， medium and high dose （0.51 mg/kg， 1.02 mg/kg， 2.04 mg/kg） combined group. After intragastric administration in rats， the mass concentration of curcumin in animal tissues at different time points was determined by HPLC. The targeting characteristics and changes of curcumin distribution in animals after combined administration were evaluated by peak concentration ratio （Ce）， total targeting coefficient （Te）， drug distribution efficiency （Rte） and relative uptake rate （Re）.[WTHZ]Results[WTBZ] Compared with the curcumin alone group， the combination of low and medium doses of Bupleurum and curcumin can increase the distribution of curcumin in the liver， heart， spleen， lungs， and kidneys. In the high-dose group， except for the spleen， other organs Drug distribution decreased. Conclusion Compared with curcumin alone， the combination of curcumin and low- and medium-dose Bupleurum has significant effects on tissue distribution. Bupleurum has the effect of introducing curcumin into the liver meridian in rats.

Keywords：Medicinal Guide;Bupleurum Radix;Curcumin;Tissue Distribution

姜黃素（Curcumin，Cur）是從姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種天然多酚類化合物，具有廣泛的藥理活性、抗癌譜廣且毒副作用小[1-2]，可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制其生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)等[3]。柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，來(lái)源于[4]傘形科植物柴胡（Bupleurumchinense DC）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd）的干燥根（本研究所用柴胡為前者）。其味苦，性微寒，歸肝膽經(jīng)，是公認(rèn)的肝經(jīng)引經(jīng)藥[5-6]。柴胡作為引經(jīng)藥使用在很多中藥古方中可以見(jiàn)到，如《太平惠民合劑局方》中的逍遙散、《醫(yī)方集解》中的龍膽瀉肝湯，用柴胡舒利肝膽，并能引諸藥歸肝膽經(jīng)[6]。現(xiàn)代中醫(yī)臨床在辨證論治的基礎(chǔ)上選用引經(jīng)藥也取得了很大成效，郭利華應(yīng)用不同中藥引經(jīng)藥治療腫瘤，效果良好[7];石氏傷科在治療骨傷疾患時(shí)非常注重引經(jīng)藥的應(yīng)用，胸脅部使用肝經(jīng)引經(jīng)藥柴胡、香附藥對(duì)，上肢選用桂枝，下肢選用牛膝等[8]。

本研究以姜黃素為模型藥物，將姜黃素與引經(jīng)藥柴胡合用，通過(guò)柴胡對(duì)姜黃素在大鼠體內(nèi)分布的影響研究，驗(yàn)證引經(jīng)藥可“引藥入病所”的靶向增效作用。同時(shí)將中醫(yī)藥引經(jīng)理論與藥物作用相結(jié)合，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代藥學(xué)理論來(lái)對(duì)柴胡的引經(jīng)作用進(jìn)行研究，為柴胡輔助肝靶向制劑給藥提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;HSC-12A氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）;TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;XK96-A快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）;BT25S分析天平（賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 姜黃素對(duì)照品（純度：98.7%，批號(hào)：110823-201706），尼群地平對(duì)照品（純度：99.4%，批號(hào)：100585-201705）均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;姜黃素（純度≥98%，批號(hào)：DST181126—043，成都德思特生物技術(shù)有限公司）甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重（220±20）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證：SCXK（湘）2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse-C18（5 μm，4.6×250 mm）;柱溫：40 ℃;流動(dòng)相：1%冰乙酸∶乙腈（48∶52）;檢測(cè)波長(zhǎng)426 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 藥液、對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 藥液制備 ①柴胡提取液的制備：用水加熱回流提?。?0倍水加熱回流3次，每次30 min），并分別調(diào)整藥物濃度為每mL含生藥0.05 g、0.1 g和0.2 g。

②姜黃素混懸液的制備：按大鼠體重稱取姜黃素，加入適量純凈水，攪拌均勻即得。

③姜黃素與柴胡混合液的制備：按大鼠體重稱取姜黃素，加入適量柴胡提取液，攪拌均勻即得。

2.2.2 姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取姜黃素對(duì)照品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1.004 mg/mL的姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密稱取內(nèi)標(biāo)尼群地平對(duì)照品于容量瓶中，加甲醇定容，制成含尼群地平對(duì)照品7.50 mg/mL的溶液，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品處理方法

2.3.1 組織勻漿的制備 大鼠禁食12 h，自由飲水，在固定時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，迅速取出肝、心、脾、肺、腎組織，用生理鹽水洗凈各組織表面的殘血，濾紙吸干，精密稱取各組織臟器1 g，剪碎，加入0.7 mL生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，再加入適量生理鹽水使其體積為3 mL。

2.3.2 組織樣品的處理 精密吸組織勻漿液500 μL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，混勻后加入乙腈3 mL，渦旋3 min，6000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL水?。?0±0.5）℃氮?dú)饬飨麓蹈?，?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋3 min，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別制備大鼠空白肝、心、脾、肺、腎組織空白勻漿液，含姜黃素對(duì)照品的各組織勻漿液，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法處理按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)。在上述色譜條件下，內(nèi)源性雜質(zhì)與姜黃素和內(nèi)標(biāo)分離良好，不干擾待測(cè)物的測(cè)定，表明該方法的專屬性好。如圖1所示。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入到各空白組織勻漿液中，制成姜黃素質(zhì)量濃度為0.100、0.502、1.004、5.020、10.040、15.060 μg/mL的質(zhì)控樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下進(jìn)行處理，記錄色譜圖，以姜黃素和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，作標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程見(jiàn)表1）。以姜黃素峰信噪比為3時(shí)樣品濃度為最低檢測(cè)限，測(cè)得其最低檢測(cè)限為0.100 μg/mL。

2.4.3 回收率試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入到各空白組織勻漿液中，制成姜黃素低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度（0.151、5.020、12.200 μg/mL）的質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣，檢測(cè)并記錄姜黃素峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)的峰面積（Ai）的比值W1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的含量，將樣品的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，計(jì)算方法回收率。另精密移取低、中、高3個(gè)濃度的姜黃素對(duì)照品溶液，加入20 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋3 min混勻，水?。?0±0.5）℃氮?dú)饬飨麓蹈珊蠹?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋3 min，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)進(jìn)樣測(cè)定，記錄姜黃素峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)的峰面積（Ai）的比值W2，W1/W2得萃取回收率。結(jié)果表明，姜黃素的方法回收率和萃取回收率的RSD均≤7.36%，符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求。見(jiàn)表2。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備姜黃素低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度（0.151、5.020、12.200 μg/mL）的質(zhì)控樣品，按照“2.3.2”和“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)，在同一天內(nèi)不同時(shí)間測(cè)定5次，進(jìn)行日內(nèi)精密度考察，在相同條件下每隔1 d測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定3 d，進(jìn)行日間精密度考察。結(jié)果顯示，各組織勻漿的日內(nèi)與日間精密度相關(guān)RSD均≤5.84 %，符合生物樣品中方法學(xué)的要求。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備姜黃素低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度（0.151、5.020、12.200 μg/mL）的質(zhì)控樣品，考察室溫放置12 h，-20 ℃反復(fù)凍融3次，-80 ℃放置兩周條件下樣品的穩(wěn)定性。在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中不同條件下樣品溶液中姜黃素含量的RSD均≤9.41 %，結(jié)果表明含姜黃素的血漿和組織樣品在室溫放置12 h，-20 ℃反復(fù)凍融3次，-80 ℃放置兩周的條件下具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 組織分布學(xué)研究[9-10]

2.5.1 大鼠給藥及取材 取雄性SD大鼠20只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，分別為姜黃素（500 mg/kg）單用組，以及姜黃素（500 mg/kg）分別與高、中、低劑量柴胡（0.51 mg/kg、1.02 mg/kg、2.04 mg/kg）合用組，每組5只，隔夜禁食不禁水，采用大鼠分別灌服姜黃素、姜黃素與柴胡混合液。給藥后分別于0、5、15、30、45 min處死，迅速取出肝、心、脾、肺、腎，用生理鹽水洗凈各組織表面的殘血，濾紙吸干，稱重，同“2.3”項(xiàng)下處理，制備待測(cè)樣品，按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定分析。

2.5.2 藥物組織分布圖 姜黃素聯(lián)合低劑量、中劑量柴胡組口服給藥后，姜黃素在肝臟、脾臟中的分布都比較多，15 min時(shí)姜黃素聯(lián)合低劑量組藥物在肝臟中分布最多。姜黃素聯(lián)合低劑量柴胡組大鼠姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在肝臟中最高，其次是脾臟，在肺臟中最低。其大鼠肝臟、脾臟、腎臟組織中姜黃素質(zhì)量濃度均高于另外三組。姜黃素給藥后經(jīng)體循環(huán)快速富集于肝臟和脾臟，而在其他組織中分布較少。如圖2所示。

2.5.3 靶向性評(píng)價(jià)[8，10-11] 為了更好的評(píng)價(jià)引經(jīng)藥柴胡對(duì)姜黃素在大鼠體內(nèi)組織分布的影響，引入以下參數(shù)：峰濃度比（Ce）、總靶向系數(shù)（Te）、藥物分布效率（Rte）和相對(duì)攝取率（Re）。

Ce=（Cmax）m /（Cmax）s

Te=AUC（各個(gè)）/AUC（總和）

Rte=（Te）m/（Te）s

Re=（AUCi）m /（AUCi）s

注：m、s分別表示姜黃素與柴胡合用組和姜黃素單用組

其中，Te表示某組織藥物占所測(cè)各臟器中總藥量的百分比;兩種制劑在某組織中的藥物分布效率可用Rte表示，Rte>1，表示藥物對(duì)組織臟器的選擇性強(qiáng)，即靶向性強(qiáng);Re表示在某一器官或組織內(nèi)兩種不同制劑的藥物分布情況，Re>1表示在該器官或組織有靶向增強(qiáng)作用，越大增強(qiáng)效果越好，<1則表示無(wú)靶向增強(qiáng)作用。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，姜黃素聯(lián)合低、中劑量柴胡組與姜黃素單用組相比，姜黃素在肝、脾、腎組織藥物濃度較高，其中在肝臟中藥物濃度顯著增加。此外，姜黃素聯(lián)合低劑量柴胡組和姜黃素聯(lián)合中劑量柴胡組姜黃素在大鼠肝臟和脾臟中AUC分別是姜黃素單用組的1.3、1.4、1.1、1.1倍。靶向性相關(guān)結(jié)果表明，當(dāng)姜黃素和低劑量、中劑量的柴胡合用時(shí)，肝靶向作用明顯，峰濃度比分別為1.94、1.47，相對(duì)攝取率分別為1.29、1.10，而與高劑量的柴胡合用時(shí)則無(wú)靶向性。同樣，姜黃素與高、中、低劑量的柴胡合用都具有較強(qiáng)的脾臟引經(jīng)作用。此外，姜黃素與中劑量的柴胡合用時(shí)，姜黃素在心臟、肺臟、腎臟的選擇性比與低劑量的柴胡合用時(shí)的強(qiáng)。

3 討論

低劑量的柴胡與姜黃素合用可增加姜黃素在肝臟、脾臟的分布，中劑量的柴胡與姜黃素合用可增加姜黃素在肝臟、心臟、脾臟、腎臟的分布，而高劑量的柴胡與姜黃素合用后除了脾臟，其它臟器的藥物分布均減少。以峰濃度比、總靶向系數(shù)、藥物分布為評(píng)價(jià)指標(biāo)，低劑量柴胡組肝靶向效果最好，表明柴胡的肝靶向性與其劑量存在一定的關(guān)聯(lián)性。

引經(jīng)藥的應(yīng)用是中醫(yī)方劑配伍的一大特色，其作用是使藥物有效成分靶向集中于特定的部位，從而提高療效，其應(yīng)用在臨床上頗具意義[12-16]。本研究中，姜黃素配伍引經(jīng)藥柴胡后，大鼠的肝、心、脾、肺、腎組織藥物濃度均有一定的增加。其中在肝臟中藥物濃度顯著增加，說(shuō)明了柴胡的引經(jīng)作用與其改變藥物體內(nèi)分布直接相關(guān)。本研究將中醫(yī)藥引經(jīng)理論與藥代動(dòng)力學(xué)研究方法結(jié)合，探討了引經(jīng)藥柴胡對(duì)姜黃素在大鼠體內(nèi)分布的影響，結(jié)果表明，柴胡對(duì)姜黃素在大鼠體內(nèi)具有引藥入肝經(jīng)的作用。同時(shí)本研究也為柴胡引經(jīng)的有效性提供了依據(jù)，同時(shí)為柴胡輔助肝靶向制劑給藥提供新的思路。

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（收稿日期：2020-04-20 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目[No.2018FF001-（030）];云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;云南省中醫(yī)治未病理論應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（No.云科人發(fā)[2016]10號(hào)）;云南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)培育計(jì)劃（No.2017DG006）。

作者簡(jiǎn)介：李嬌（1993-），女，彝族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴幩巹┡c新藥研究。E-mail：279566208@qq.com

通信作者：侯安國(guó)（1972-），男，漢族，碩士，教授、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩巹┡c新藥研究。E-mail：1324491101@qq.com