核桃低聚肽對db/db小鼠血糖的影響

劉欣然 康家偉

摘要：目的：研究核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）干預(yù)對db/db糖尿病模型小鼠血糖的影響作用。方法：選擇db/db糖尿病小鼠模型，將其隨機(jī)分為3個核桃低聚肽組（220、440、880mg/kg·BW）、糖尿病模型對照組、二甲雙胍對照組、乳清蛋白對照組;并選用db/m小鼠作為非糖尿病小鼠空白對照。經(jīng)過為期6周的干預(yù)，檢測小鼠空腹血糖、餐后血糖以及糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖曲線下面積。結(jié)果：核桃低聚肽（880mg/kg·BW）可降低db/db糖尿病小鼠空腹血糖水平和餐后血糖水平，同時能有效改善糖耐量（P<005）。結(jié)論：核桃低聚肽干預(yù)可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，改善糖耐量，具有輔助降血糖功能。

關(guān)鍵詞：核桃低聚肽;降血糖;糖耐量;db/db糖尿病小鼠

2017年全球糖尿病相關(guān)醫(yī)療支出高達(dá)8 500億美元[1]，防治糖尿病及其并發(fā)癥已成為科學(xué)工作者研究的重點(diǎn)，而控制血糖水平則是重中之重。研究發(fā)現(xiàn)，許多植物來源的生物活性肽可具有降血糖的功效，如燕麥低聚肽、人參低聚肽和苦瓜多肽等[25]。核桃含有豐富的蛋白質(zhì)以及人體所需的不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、纖維素等。核桃中蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)到297%，有著豐富的營養(yǎng)價值及資源開發(fā)前景[67]。目前已有關(guān)于核桃及核桃多肽的研究顯示其具有一定的降血糖作用[810]，而低聚肽具有更短小的氨基酸組成，理論上應(yīng)比多肽更易吸收且活性更強(qiáng)，但目前尚未有關(guān)于核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）降血糖的研究。因此，本研究探討WOPs對血糖調(diào)節(jié)的作用。

1材料與方法

11受試物

WOPs，淡黃色固體粉末，是利用酶解技術(shù)從核桃仁中得到的小分子生物活性肽的混合物，其中相對分子質(zhì)量小于1 000D的小分子低聚肽占875%。

12實(shí)驗(yàn)動物

選擇12周齡SPF級雄性db/db型糖尿病小鼠（空腹血糖水平≥111mmol/L）48只及與之周齡、性別匹配的非糖尿病健康同窩出生仔畜db/m小鼠（lepr/m）10只。db/db小鼠及正常健康小鼠db/m均由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。動物飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施（屏障環(huán)境）合格證書：醫(yī)動字第 012055。動物分籠飼養(yǎng)，每籠2只，均給予普通飼料，飼養(yǎng)環(huán)境符合屏障環(huán)境，溫度為（25±1）℃，相對濕度為50%～60%RH，室內(nèi)照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。動物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照《北京市實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》執(zhí)行，動物合格證號：SCXK（京）2016—0010。

13主要試劑和儀器

葡萄糖，純度：998%，北京金匯太亞化學(xué)試劑有限公司;濃縮乳清蛋白Lacprodan 80，純度：792%，北京中柏創(chuàng)業(yè)化工產(chǎn)品有限公司;格華止鹽酸二甲雙胍片國藥準(zhǔn)字H20023370，中美上海施貴寶制藥有限公司;三諾安穩(wěn)血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司;三諾安穩(wěn)血糖儀，長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司。

14分組、劑量及干預(yù)方式

將48只db/db小鼠按空腹血糖水平隨機(jī)分為6組：1個模型對照組、1個陽性對照組（220 mg/kg·BW鹽酸二甲雙胍腸溶片水溶液）、1個乳清蛋白對照組（440mg/kg·BW乳清蛋白水溶液）和3個核桃低聚肽劑量組（220、440、880 mg/kg·BW），每組8只。10只db/m小鼠作為空白對照組。各組干預(yù)方式均為每日經(jīng)口灌胃，持續(xù)6周，實(shí)驗(yàn)期間動物自由進(jìn)食、飲水。分組及干預(yù)劑量見表1。

15檢測指標(biāo)及方法

151一般情況每日觀察各組小鼠狀態(tài)，定期記錄攝食和體重等情況。

152血糖及口服糖耐量實(shí)驗(yàn)于干預(yù)第2周、第4周和第6周時禁食5h后取小鼠尾靜脈血，用微量血糖儀檢測空腹血糖。于干預(yù)第6周時進(jìn)行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)，具體操作方法為：小鼠禁食6h 后，給予004mL/kg 50%葡萄糖溶液灌胃，于灌胃后第0、05、1、2h 取尾靜脈血測其血糖水平記錄并計(jì)算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）。根據(jù)近似梯形面積公式計(jì)算，AUC=（0h血糖+05h血糖）×05h/2+（05h血糖+1h血糖）× 05h/2+（1h血糖+2h血糖）× 1h/2。

16數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位間距）表示。采用SPSS 240軟件進(jìn)行單因素方差分析或獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

21一般情況

在干預(yù)期間，空白對照組小鼠（db/m）毛色黑亮有光澤，精神狀態(tài)良好。模型對照組皮毛松散，體表潮濕，精神狀態(tài)較差，活動量明顯少于空白對照組。而WOPs干預(yù)后的小鼠毛色及精神狀況逐漸有所好轉(zhuǎn)，活動量有所增加，干預(yù)時期內(nèi)極少出現(xiàn)感染癥狀（如尿道感染等）。干預(yù)期間，各糖尿病組（db/db）小鼠體重及攝食量均高于空白對照組（db/m）小鼠（圖1），這與2型糖尿病“三多”癥狀相吻合，但糖尿病小鼠各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

22WOPs對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

干預(yù)前，空白對照組小鼠空腹血糖均值為754mmol/L，而db/db 2型糖尿病模型小鼠空腹血糖值均大于111mmol/L，符合2型糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)，在干預(yù)期間，模型對照組小鼠空腹血糖也并無明顯變化，這說明該試驗(yàn)所采用的db/db 2型糖尿病模型小鼠血糖較為穩(wěn)定，符合后續(xù)研究的需要。由圖2可見，干預(yù)期間db/db糖尿病小鼠空腹血糖均明顯高于正常組小鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<005）;而相比模型對照組小鼠，WOPs干預(yù)的3組小鼠空腹血糖均有所降低，特別是WOPsHG組小鼠空腹血糖的降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。從數(shù)值上來看，干預(yù)2、4、6周時WOPsHG組小鼠空腹血糖較模型對照組血糖下降率分別為294%、401%、350%，說明WOPs對糖尿病小鼠有較好的降低空腹血糖作用。

23WOPs對糖尿病小鼠餐后血糖及血糖曲線下面積的影響

干預(yù)后（6周）進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)，以給予葡萄糖后2h的血糖值作為餐后血糖指標(biāo);同時通過糖耐量實(shí)驗(yàn)得到的給予葡萄糖后0、05、1、2h的血糖值計(jì)算曲線下面積（表2）。空白對照組及WOPsHG組餐后血糖及血糖曲線下面積均顯著低于糖尿病模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）;陽性對照組的血糖曲線下面積也顯著低于糖尿病模型對照組（P<005）。

3討論

研究WOPs的血糖調(diào)節(jié)作用首先需要依賴于糖尿病動物模型。目前國內(nèi)外主要使用的糖尿病模型動物主要分為自發(fā)性模型動物、轉(zhuǎn)基因模型動物和誘發(fā)性模型動物等。在諸多動物模型中，db/db小鼠是屬于自發(fā)性模型動物中比較優(yōu)質(zhì)的用來研究2型糖尿病的模型小鼠，價格也比較昂貴，它是由C57BL/KsJ近親交配株常染色體隱性遺傳衍化而來。純合的自發(fā)突變小鼠在3～4周齡時產(chǎn)生可以辨認(rèn)的肥胖表型;出生后10～14d，血漿胰島素和血糖開始升高，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的“三多”癥狀，其存活壽命為10個月左右。db/db小鼠的糖尿病發(fā)生發(fā)展近似人類糖尿病病理改變過程，適合用于外物干預(yù)下的糖尿病降糖作用研究，模型持續(xù)時間長，可為后續(xù)的研究奠定穩(wěn)固的基礎(chǔ)[11]。

糖尿病患者糖調(diào)節(jié)受損（IGR）可分為兩種狀態(tài)，即空腹血糖受損（IFG）和糖耐量受損（IGT）[12]。控制空腹血糖的平穩(wěn)降低對于防治糖尿病及其并發(fā)癥有著重要的意義，本研究發(fā)現(xiàn)，最高劑量WOPs干預(yù)后的小鼠空腹血糖顯著低于模型對照組，說明WOPs可以有效降低空腹血糖;同時鑒于WOPsHG組血糖也低于陽性對照組和乳清蛋白對照組，由此對比說明此劑量下的降糖作用與額外添加的氨基酸無關(guān)，體現(xiàn)出了生物活性肽比蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的功能優(yōu)勢。而針對IGT，本研究關(guān)注了WOPs干預(yù)后的小鼠餐后血糖和血糖曲線下面積變化，發(fā)現(xiàn)WOPsHG組餐后血糖顯著低于模型對照組及乳清蛋白對照組，鑒于餐后血糖反映的是機(jī)體糖負(fù)荷后的耐受，此結(jié)果也說明了WOPs干預(yù)可以有效改善胰島β細(xì)胞的儲備功能。血糖曲線下面積也是一種反映血糖水平的指標(biāo)，相較于單點(diǎn)的血糖值，血糖曲線下面積能更全面地分析血糖變化的時間和程度，體現(xiàn)了動態(tài)波動的情況。而從結(jié)果來看，WOPsHG組的曲線下面積顯著低于糖尿病模型組，說明WOPs可以有效控制短時間內(nèi)的血糖波動，促進(jìn)血糖快速回歸較低水平。雖然結(jié)果中WOPsHG組血糖曲線下面積低于陽性藥物對照組，但數(shù)值上較為接近，仍可以說明WOPs的干預(yù)對于改善IGT具有重要的作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的生物活性肽都具有降血糖的作用[23，1314]，并且低聚肽比蛋白質(zhì)和多肽更易消化，吸收速度甚至高于氨基酸，耗能低，可減輕腎臟代謝負(fù)擔(dān)，具有獨(dú)特的生理功能和理化性質(zhì)，這是蛋白質(zhì)或氨基酸所不具備的，且低聚肽分子量越小其功能特性越明顯。本研究已經(jīng)證明了WOPs具有輔助降血糖作用，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值，但目前有關(guān)WOPs對于血糖影響的機(jī)制研究暫無，通過本研究得到的結(jié)果以及前人關(guān)于核桃蛋白及核桃多肽降血糖的研究，推測WOPs的降血糖機(jī)制可能與抑制α葡萄糖苷酶、提高葡萄糖消耗能力等機(jī)制有關(guān)[89]，需要今后開展更深入的探究討論其降糖機(jī)制。

4結(jié)論

本研究以db/db小鼠為糖尿病模型小鼠，設(shè)立不同劑量的WOPs干預(yù)組和多種對照組，探討WOPs對糖尿病小鼠的血糖調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，WOPs具有降低糖尿病小鼠空腹血糖、餐后血糖及血糖曲線下面積的作用，這對于降低糖尿病患者血糖以及防治糖尿病有著重要意義?！?/p>

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