馮海斌，張巍，李琴，柴巧英，韓繼如，李娟

氧化應(yīng)激(OS)是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要因素，并涉及多種心血管疾病的病理生理，如缺血/再灌注損傷、動脈粥樣硬化、心力衰竭和高血壓[1-2]。OS表現(xiàn)為活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生，后者破壞細(xì)胞的氧化還原平衡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和器官功能障礙等一系列事件[3]。要恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞會激活未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)信號通路，這些通路由活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、肌醇需求激酶1α(IRE1α)和蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)調(diào)節(jié)[4]。因此，每個UPR通路的差異調(diào)節(jié)可能是治療心血管疾病的一種治療策略。研究表明，ATF6的激活可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白的表達(dá)，從而避免錯誤折疊的蛋白，包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、GRP94和蛋白二硫化物異構(gòu)酶A6(PDIA6)[5]。此外，ATF6的激活還誘導(dǎo)抗OS基因[6]。這些研究表明，ATF6對OS具有重要的保護(hù)功能。川續(xù)斷皂苷Ⅵ是川續(xù)斷的主要活性成分，具有抗氧化和抗炎等生物學(xué)效應(yīng)，可以保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞免受過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的損傷，但其機(jī)制尚不清楚[7]。因此，本研究探討川續(xù)斷皂苷Ⅵ對H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞： H9c2心肌細(xì)胞(上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)。(2)試藥試劑：川續(xù)斷皂苷Ⅵ(四川省維克奇生物科技有限公司，純度 99.9%)；30% H2O2(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，細(xì)胞計數(shù)試劑盒8 (CCK-8,美國Amresco公司)；2' 7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、 乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ECL試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測AnnexinV/PI試劑盒和細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯膜(碧云天生物技術(shù)研究所)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl關(guān)聯(lián)性X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、ATF6、GRP78、PDIA6和GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠IgG抗體(武漢艾美捷科技有限公司)。(3)儀器：EliteⅡ型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Revco公司)，S-450D型超聲波細(xì)胞破碎儀(美國BRANSON公司)，HBS-1096B型酶標(biāo)儀(南京德鐵實驗設(shè)備有限公司)，DYCZ-28型BD垂直電泳儀和BD FACSCanto型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；BioSpectrum型凝膠成像儀(美國UVP公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組 2019年6—9月于邯鄲市第一醫(yī)院實驗室進(jìn)行實驗。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2下培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時進(jìn)行實驗。實驗分為對照組、H2O2組及川續(xù)斷皂苷Ⅵ低、中、高劑量組。對照組加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，H2O2組加入終濃度為200 μmol/L的H2O2，川續(xù)斷皂苷Ⅵ低、中、高劑量組加入終濃度為25、50、100 μmol/L的川續(xù)斷皂苷Ⅵ，同時給予終濃度為200 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測[8-9]。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 CCK-8 法檢測H9c2細(xì)胞增殖率：將H9c2細(xì)胞以5×103個/孔接種于96孔板中(200 μl /孔)，待細(xì)胞融合后，按上述實驗方法給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ和H2O2進(jìn)行干預(yù)20 h，向培養(yǎng)板中加入 CCK-8試劑10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在630 nm處測定吸光度值(OD值)，計算細(xì)胞增殖率(細(xì)胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值)。

1.3.2 H9c2細(xì)胞凋亡率檢測：將H9c2細(xì)胞以5×104個/孔接種于6孔板內(nèi)(3 ml/孔)，待細(xì)胞融合后，按上述實驗方法給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ和H2O2進(jìn)行干預(yù)24 h，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測AnnexinV/PI試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.3 H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH和MDA的測定：將H9c2細(xì)胞以5×104個/孔接種于6孔板內(nèi)(3 ml/孔)，待細(xì)胞貼壁后，按上述實驗方法給予川續(xù)斷皂苷Ⅵ和H2O2進(jìn)行干預(yù)24 h，棄培養(yǎng)基，采用DCFH-DA探針聯(lián)合酶標(biāo)儀法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平；接種孔內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液2 ml，用超聲波細(xì)胞破碎儀處理30 s，離心收集上清液，按試劑盒說明書檢測細(xì)胞中LDH、MDA水平。

1.3.4 H9c2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3、ATF6、GRP78和PDIA6水平檢測：采用Western-blot法檢測。將H9c2細(xì)胞以5×104個/孔接種于6孔板內(nèi)(3 ml/孔)，待細(xì)胞貼壁后，按上述實驗方法干預(yù)24 h，棄培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞量加入細(xì)胞蛋白抽提液，裂解2 h；離心取上清進(jìn)行蛋白定量；調(diào)整蛋白濃度，加入1/5體積的5×Buffer，沸水進(jìn)行變性，進(jìn)行電泳(每孔上樣量為20 μg)，將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶400)、Caspase-3(1∶300)、ATF6(1∶500)、GRP78(1∶200)、PDIA6(1∶500)和GAPDH(1∶5 000)抗體進(jìn)行孵育，4℃過夜，用TBST緩沖液對膜進(jìn)行2次沖洗，將膜與辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)在室溫下孵育30 min。進(jìn)行顯色，采集圖像進(jìn)行分析。采用ECL染液進(jìn)行顯色，然后用BioSpectrum型凝膠成像儀定量分析蛋白表達(dá)強(qiáng)度，以GAPDH表達(dá)作為內(nèi)控。

2 結(jié) 果

2.1 各組H9c2細(xì)胞增殖和凋亡比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續(xù)斷皂苷Ⅵ組H9c2細(xì)胞增殖率升高，凋亡率降低，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組H9c2細(xì)胞增殖和凋亡情況比較

2.2 各組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH和MDA水平比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH和MDA水平均升高(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續(xù)斷皂苷Ⅵ組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH和MDA水平均降低，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 各組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH和MDA水平比較

2.3 各組H9c2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Caspase-3水平比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2水平降低，Bax和Caspase-3水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續(xù)斷皂苷Ⅵ組H9c2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2水平增加，Bax和Caspase-3水平降低，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 各組H9c2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Caspase-3水平比較

2.4 各組H9c2細(xì)胞內(nèi)ATF6、GRP78和PDIA6水平比較 與對照組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞內(nèi)ATF6、GRP78和PDIA6水平均降低(P<0.01)；與H2O2組比較，各川續(xù)斷皂苷Ⅵ組H9c2細(xì)胞內(nèi)ATF6、GRP78和PDIA6水平增加，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖3。

表4 各組H9c2細(xì)胞內(nèi)ATF6、GRP78和PDIA6水平比較

3 討 論

研究表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過限制腦缺血/再灌注損傷，增加微血管數(shù)量并改善腦缺血后的血流發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。川續(xù)斷皂苷Ⅵ還可減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和ROS水平的增加，并增強(qiáng)局灶性腦缺血大鼠皮質(zhì)組織中抗氧化酶的活性[11]。然而，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對心肌細(xì)胞氧化損傷的作用及其機(jī)制尚不清楚。H9c2是源自BD1X大鼠心室的克隆細(xì)胞系，具有許多心肌的電生理、離子通道和受體等特性[12]。H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞模型已被廣泛用于確定心臟氧化損傷的發(fā)病機(jī)制及其治療策略[13]。本研究單獨(dú)用H2O2處理可以顯著增加H9c2細(xì)胞中ROS、LDH和MDA水平，用川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后能減弱H2O2對H9c2細(xì)胞的損傷，表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有抗氧化作用。

ROS直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并引發(fā)一系列事件，加劇細(xì)胞損傷，參與了與炎性反應(yīng)、代謝和凋亡相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，ROS的過度生成會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，干擾蛋白質(zhì)的正確折疊，最終啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路，加重心肌細(xì)胞損傷[14]。在嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，促凋亡的轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。CHOP的激活改變了凋亡相關(guān)蛋白，如Bax和Bcl-2[15]。Bcl-2和Bax基因在決定細(xì)胞凋亡后的存活或死亡中起主要作用。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的另一種主要凋亡相關(guān)蛋白，其激活間接激活了胞質(zhì)Caspase-3，Caspase-3是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的主要效應(yīng)蛋白酶[16]。本研究中川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理抑制了H2O2的作用，降低了細(xì)胞凋亡率、Bax和Caspase-3水平，增加了細(xì)胞增殖率、Bcl-2水平，表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ對H2O2誘導(dǎo)損傷的保護(hù)作用涉及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，和上述文獻(xiàn)研究一致。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最初會觸發(fā)一個適應(yīng)性UPR過程以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未能解決，則UPR會抑制適應(yīng)性反應(yīng)并觸發(fā)細(xì)胞凋亡。3種ER跨膜蛋白，即ATF6、IRE1a和PERK，通過靶向不同的基因來動員UPR。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯K通過激活I(lǐng)RE1a信號來保護(hù)心臟免受衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17]；PERK激活在β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡中起重要作用[18]。與IRE1a和PERK相反，在心肌缺血/再灌注期間，UPR的ATF6通路在響應(yīng)ROS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起主要作用[19]。在體內(nèi)和離體模型及培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，ATF6表達(dá)上調(diào)對缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。使用轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究表明，激活A(yù)TF6可保護(hù)心臟免受缺血/再灌注損傷[20]。ATF6激活會結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件，導(dǎo)致ATF6誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(如GRP78、GRP94和PDIA6)的表達(dá)增加[21]。預(yù)先誘導(dǎo)的GRP78保護(hù)心肌細(xì)胞免于OS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并且H9c2細(xì)胞中GRP94過表達(dá)減少了應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；PDIA6通過增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊，保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[22-23]。此外，對小鼠心臟中ATF6基因缺失的研究表明，內(nèi)源性ATF6對缺血/再灌注損傷具有重要的保護(hù)作用，因為它是誘導(dǎo)多種抗氧化劑蛋白[如過氧化氫酶(Catalase，CAT)]所必需的。CAT中和了ATF6中大量的ROS，通過將H2O2轉(zhuǎn)化為O2和水，從而減輕OS損傷[24]。本研究結(jié)果顯示，川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理激活了H2O2處理的H9c2細(xì)胞中ATF6及其下游基因GRP78和PDIA6水平升高，表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過ATF6通路發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，川續(xù)斷皂苷Ⅵ通過激活A(yù)TF6通路，減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，為川續(xù)斷皂苷Ⅵ治療心肌損傷的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

馮海斌：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；張巍：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；李琴：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；柴巧英：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；韓繼如、李娟：課題設(shè)計，論文撰寫