魏建國，孫麗莉，魏濤，劉華敏，潘樂

（1.黃山學院 化學化工學院，安徽 黃山 245041；2.安徽中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，安徽 合肥 230088）

據《中華本草》記載節(jié)節(jié)草具有清熱、明目、止血、利尿的功效[1]. 現代研究表明節(jié)節(jié)草含有多種有效組分，如：氨基酸、黃酮、多酚、多糖、總生物堿等[2-4]. 最近，天然產物中黃酮的提取引起人們關注，人們對節(jié)節(jié)草中的總黃酮的提取展開了一定的研究. 例如，李國慶等[5]采用索氏提取法提取了節(jié)節(jié)草中的總黃酮，付影超等[6]采用溶劑回流法提取了節(jié)節(jié)草中的總黃酮. 這些方法可以有效提取節(jié)節(jié)草中的總黃酮，但是存在著耗時較長的缺點.

超聲提取是天然物質活性成分提取的一種有效方法[7-8]. 張俊生等[9]采用超聲技術對節(jié)節(jié)草中的黃酮進行了研究，在耗時較短的情況下有效提取了節(jié)節(jié)草中的總黃酮，在最佳工藝條件下節(jié)節(jié)草總黃酮得率為1.16%. 蘆宇等[10]在纖維素酶酶解細胞壁的基礎上，采用超聲技術快速高效提取了紅樹莓籽中的黃酮類化合物. 然而，迄今為止尚未見到有關纖維素酶輔助超聲提取節(jié)節(jié)草黃酮的報道. 本文研究了纖維素酶輔助超聲提取節(jié)節(jié)草總黃酮的工藝，通過正交設計確定了該法的最佳工藝條件，并對提取物的抗氧化活性進行了檢測.

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

儀器：紫外可見分光光度計UV-1100 型，上海美譜達儀器有限公司，K-500DB 型超聲清洗儀，合肥金尼克機械制造有限公司.

試劑：蘆丁標準品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號140428）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、水楊酸、維生素C（VC）、維生素E（VE）、過氧化氫，均為分析純. 2018 年9 月購買節(jié)節(jié)草于淘寶皇冠店“亳州市九林中藥材銷售”（經黃山學院生命與環(huán)境學院吳永祥副教授鑒定為木賊屬節(jié)節(jié)草Equisetum ramosissimum Desf，樣本存放于黃山學院逸夫綜合樓5419 實驗室）. 購買的節(jié)節(jié)草經水洗后晾干，然后置于40°C 烘箱干燥三天. 干燥后的樣品粉碎，過60 目篩，密封于塑料封口袋中并置于冰箱冷藏室（2 ～8°C ）保存.

1.2 節(jié)節(jié)草總黃酮的提取

精密稱取2.000 g 節(jié)節(jié)草干燥粉末，用石油醚浸泡過夜，過濾去除石油醚，待殘留的石油醚揮發(fā)后，將脫脂后的節(jié)節(jié)草粉末轉入250 mL 錐形瓶. 往錐形瓶中加入適量的纖維素酶（20 ～60 mg/g），按預定的液料比（ 20 ： 1～60 ：1 mL/g）、溫度（35 ～75°C）、時間（20 ～60 min）用體積分數為60%乙醇作為提取劑進行超聲提取. 滅活后過濾并棄去節(jié)節(jié)草固體殘渣，將濾液轉移至100 mL 容量瓶，用60%（V/V）乙醇定容. 精密吸收10 mL，置于100 mL 棕色容量瓶中，加水定容，搖勻，即得樣品溶液.

1.3 節(jié)節(jié)草總黃酮的測定方法

精密量取1 mL 樣品溶液，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，充分搖勻后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻放置6 min 后加入5 mL 10% NaOH 溶液，用60%乙醇定容，搖勻放置15 min 后，在波長510 nm 處測定其吸光度. 用空白試劑作為參比，按照實驗測得的標準曲線方程y=0.012 5x+0.0613（R2=0.999 9）計算濃度.

1.4 節(jié)節(jié)草總黃酮抗氧化性實驗

節(jié)節(jié)草總黃酮抗氧化性實驗采用 Fenton 法. 取2 mL 0.020 mg/mL 的節(jié)節(jié)草總黃酮樣品（VC、VE）溶液，加入 3 ×10-3mol/L FeSO4和 2 ×10-3mol/各2 mL，6 ×10-3mmol /L 水楊酸-乙醇溶液3 mL，立即搖勻，加入去離子水定容到25 mL，在37°C下水浴20 min ，用超純水做空白測量該溶液在510 nm 處的吸光度1A. 用超純水代替樣品溶液，其他操作步驟同上，測溶液在510 nm 處的吸光度記為A0，則：

2 結果與討論

2.1 纖維素酶用量的影響

2.000 g 節(jié)節(jié)草粉脫脂后，加入一定量的纖維素酶（40 ～120 mg）和80 mL 60%乙醇，在45°C 下超聲提取40 min，結果如圖1 所示. 隨著纖維素酶用量的增加，節(jié)節(jié)草總黃酮的得率出現先增加后降低的現象. 當1 g節(jié)節(jié)草樣品中加入纖維素酶用量為50 mg 時出現峰值，節(jié)節(jié)草總黃酮得率最高，隨著纖維素酶用量的進一步增加，總黃酮得率出現下降，這與蘆宇等采用超聲波-纖維素酶輔助提取紅樹莓籽黃酮的結果類似[10]，可能是酶解的纖維素吸附在顆粒表面，影響了節(jié)節(jié)草總黃酮的溶出，因此本實驗中纖維素酶的加入量選擇為50 mg/g.

2.2 超聲時間的影響

2.000 g 節(jié)節(jié)草粉脫脂后，加入100 mg 的纖維素酶和80 mL 60%乙醇，在45°C 下超聲提取一定時間. 超聲時間對節(jié)節(jié)草總黃酮得率的結果如圖2 所示. 從圖2 可以看出在20 ～50 min，節(jié)節(jié)草黃酮得率隨著超聲時間的增加而升高，并在50 min 達到峰值. 之后隨著超聲時間的增加，節(jié)節(jié)草總黃酮得率反而下降. 這可能是由于提取時間過長，黃酮類物質被空氣中氧氣逐漸氧化. 因此節(jié)節(jié)草總黃酮的最佳超聲時間為50 min.

2.3 超聲溫度的影響

2.000 g 節(jié)節(jié)草粉脫脂后，加入100 mg 的纖維素酶和80 mL 60%乙醇，在如圖3 所示溫度（35 ～75°C ）下超聲提取40 min. 從圖 3 可以看出，溫度從35°C 升高到45°C ，酶的活性增強，有利于提取黃酮類物質，提取效果大幅度增加；在45°C 到75°C 之間，得率基本維持不變. 這可能是高溫一方面促進了分子的熱運動，導致節(jié)節(jié)草總黃酮快速溶出，另一方面高溫會破壞纖維素酶的活性，不利于黃酮的提取，因此45°C 到75°C 的節(jié)節(jié)草得率恰巧基本不變. 從節(jié)省能源角度考慮，提取溫度選擇為45°C .

圖1 酶用量對節(jié)節(jié)草總黃酮得率的影響

圖2 時間對節(jié)節(jié)草總黃酮得率的影響

圖3 溫度對節(jié)節(jié)草總黃酮得率的影響

2.4 液料比的影響

2.000 g 節(jié)節(jié)草粉脫脂后，加入100 mg 的纖維素酶和一定體積的 60%乙醇，在45°C下超聲提取40 min ，液料比對節(jié)節(jié)草總黃酮提取影響如圖4 所示. 在液料比為20 ： 1～40 ：1mL/g 時，節(jié)節(jié)草總黃酮的得率隨液料比增大快速提升. 這可能是因為增加溶劑的量可以降低樣品周圍的濃度，使細胞壁內外的濃度差增大，有利于有效成分的溶出. 在液料比達到 ：40 1 mL/g 后，得率趨于穩(wěn)定. 因此考慮選取 ：40 1 mL/g 的液料比對節(jié)節(jié)草總黃酮進行提取.

2.5 正交實驗結果

確定液料比、纖維素酶用量、提取溫度和提取時間這4 個因素的水平如表1 所示. 以節(jié)節(jié)草總黃酮得率作為指標，采用四因素三水平設計的正交實驗結果如表 2所示. 觀察表2 可以看出，A 因素的極差最大，因此在纖維素酶輔助超聲提取節(jié)節(jié)草總黃酮的工藝條件中，最主要的影響因素是液料比. 以此類推，通過4 個因素的極差大小可以知道4 個因素地位為A＞C＞D＞B. 比較4 個因素均值，很容易得到節(jié)節(jié)草總黃酮最佳工藝條件為，也 就 是 液 料 比 為 50 ：1 mL/g ，酶 用 量 為60 mg/g，超聲溫度為55°C ，超聲時間為40 min.

由表2 可知，B 項的極差最小. 在沒有空列的正交數據下，可以選取極差最小的B 項作為誤差對照項，利用SPSS 軟件計算主體間效應的檢驗如表3 所示，可以看到，選取B 為誤差對照項時，A 顯著（Sig.＜0.05），C、D 項不顯著（Sig. ＞0.05）.

圖4 液料比對節(jié)節(jié)草總黃酮得率的影響

表1 正交試驗因素表

表2 正交試驗設計與結果

表3 主體間效應的檢驗

2.6 最佳工藝驗證

在液料比為 50 ：1 mL/g，酶用量為60 mg/g，超聲溫度為55°C，超聲時間為40 min 的條件下，3次實驗提取節(jié)節(jié)草總黃酮得率的平均值為1.72%.

2.7 節(jié)節(jié)草總黃酮抗氧化性的研究

Fenton 反應法會產生 ·OH，·OH氧化水楊酸產生有色物質，該物質在510 nm 處有特征吸收峰，若加入清除劑，會抑制有色物質的產生，此時吸收峰會強度減小. 通過測量吸光度A可以計算出節(jié)節(jié)草總黃酮對·OH的清除作用，從而表征其抗氧化性. 我們對濃度為0.020 mg/mL 的樣品進行了測試. 從圖5 的結果可以看出，0.02 mg/mL 的節(jié)節(jié)草總黃酮的·OH清除率達到了61.57%，高于0.02 mg/mL 的維生素E（43.65%），但比同濃度的維生素C（87.12%）要低. 因此，纖維素輔助超聲提取的節(jié)節(jié)草總黃酮具有一定的抗氧化能力.

圖5 不同樣品的 ·OH清除率(n=3)

3 結論

綜上，用正交優(yōu)化法研究纖維素酶輔助超聲提取節(jié)節(jié)草中總黃酮的最佳提取工藝條件液料比為50 ：1 mL/g，酶用量為60 mg/g，超聲溫度為55°C，超聲時間為40 min，在該條件下提取總黃酮的量為1.72%. 同時研究表明纖維素酶輔助超聲提取的節(jié)節(jié)草總黃酮具有高于同濃度維生素E 的抗氧化能力.