胡景華，趙方媛，張麗珍，江武軍，廖春華，顏偉玉*

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌 330045；2. 江西省養(yǎng)蜂研究所，南昌 330052)

中華蜜蜂Apisceranacerana(簡稱中蜂)擅于采集零星蜜源且抗胡蜂及抗蜂螨能力較強(qiáng)，是我國特有的當(dāng)家蜂種，對我國養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展以及生態(tài)系統(tǒng)的平衡均有著重要的作用(王靜等，2013)。但由于西方蜜蜂的大量引入，中蜂存在競爭劣勢使得生存資源驟減，種群的數(shù)量和分布區(qū)域均逐年下降(余林生，2007)。蜂王作為蜂群中唯一雌性生殖器官發(fā)育完全者，其專職任務(wù)就是產(chǎn)卵，因此蜂王品質(zhì)優(yōu)劣對蜂群的群勢和生產(chǎn)性能等至關(guān)重要。優(yōu)質(zhì)的蜂王不僅有利于蜂群維持強(qiáng)群，且在產(chǎn)卵性能、抗逆性以及經(jīng)濟(jì)效益等方面均有重要意義(匡邦郁，2003)。因此，培育優(yōu)質(zhì)的蜂王可以顯著提高蜂群的生產(chǎn)效益和競爭優(yōu)勢。

早期研究中單式移蟲育王的發(fā)明實(shí)現(xiàn)了人工科學(xué)育王，后期的復(fù)式移蟲則更進(jìn)一步的提高了王臺接受率和蜂王質(zhì)量(Doolittle，1888；陳世壁，1989)。Le Conte研究發(fā)現(xiàn)，在培育西方蜜蜂蜂王過程中添加幼蟲信息素成分甲基硬脂酸酯(MS)可提高王臺接受率，添加甲基亞油酸酯(ML)可促進(jìn)工蜂吐漿進(jìn)而增加王臺內(nèi)王漿量，而甲基棕櫚酸酯(MP)的使用則可提高王臺中幼蟲重量(Le Conteetal.，1995)。曾云峰等在蜂王培育過程中添加信息素，發(fā)現(xiàn)0.1% MP提高了中意蜂蜂王幼蟲的重量(曾云峰等，2010)。鄒垂彬等在中蜂育王過程中添加MP和ML，研究結(jié)果表明MP和ML并不能提高中蜂蜂王質(zhì)量(鄒垂彬等，2016)。

Gilley等在成年蜂王頭部發(fā)現(xiàn)E-β-羅勒烯，未能成功介紹到無王群的蜂王E-β-羅勒烯含量在一周內(nèi)一直處于相當(dāng)?shù)偷乃?Gilleyetal.，2006)。另外在西方蜜蜂蜂群中添加E-β-羅勒烯可以顯著提高蜂群對蜂王的接受率(Degrandi-Hoffmanetal.，2007)。在正常蜂群中由于存在蜂王信息素和幼蟲信息素，可以抑制工蜂卵巢發(fā)育，從而防止工蜂產(chǎn)卵。Maisonnase等研究發(fā)現(xiàn)幼蟲體表存在一種高揮發(fā)性物質(zhì)E-β-羅勒烯，可以有效抑制工蜂卵巢的發(fā)育(Maisonnasseetal.，2009)。E-β-羅勒烯作為一種高揮發(fā)性信息素，很容易在整個蜂群中擴(kuò)散，對各階段工蜂的生理及行為均會產(chǎn)生影響。Maisonnasse等研究表明提高蜂群中E-β-羅勒烯濃度工蜂的采集日齡會提早，以增加食物儲存量，為蜂群和幼蟲提供更優(yōu)質(zhì)和充足的營養(yǎng)(Maisonnasseetal.，2010)。此外，E-β-羅勒烯還可以促進(jìn)工蜂王漿腺的發(fā)育，從而影響蜂王漿的分泌(Traynoretal.，2014)，因此幼蟲信息素E-β-羅勒烯與幼蟲食物息息相關(guān)。后期大量研究證實(shí)，E-β-羅勒烯是蜜蜂幼蟲的饑餓信息素，它與蜂群中食物信息相關(guān)，可以在調(diào)控哺育蜂發(fā)育的同時調(diào)控整個蜂群的采集行為(Maisonnasseetal.，2010；Traynoretal.，2014)。

為了進(jìn)一步研究幼蟲信息素成分甲基硬脂酸酯和E-β-羅勒烯對中蜂育王的影響，本研究通過在育王過程中添加甲基硬脂酸酯和E-β-羅勒烯，研究其對蜂王初生重、胸重、胸寬、單側(cè)卵巢管數(shù)量以及Vg、hex70b和hex1103個基因表達(dá)量的影響，為培育優(yōu)質(zhì)中蜂蜂王提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蜂群

試驗(yàn)所需蜂群為中蜂，均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)。試驗(yàn)選取蜂群群勢(5足框)、蜂群遺傳性狀和蜂王年齡都基本相似的3群蜂作為哺育蜂群。另取1群蜂王產(chǎn)卵性能良好的健康蜂群作為母本群用于產(chǎn)卵。育王在哺育群中進(jìn)行，每群至少育王3次。試驗(yàn)期間，對蜂群進(jìn)行獎勵飼喂，提高工蜂哺育積極性。

1.2 免移蟲育王

利用中華蜜蜂免移蟲育王生產(chǎn)器(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所研制)培育蜂王，免移蟲育王的具體操作參照鄒垂彬等(2016)的試驗(yàn)方法進(jìn)行。同時，在幼蟲60～64 h時，往王臺中注入1 μL不同濃度(濃度梯度分別為0%、0.1%、1.0%、10.0%)的幼蟲信息素酯類成分(Sigma試劑公司，純度≥99%)與臺內(nèi)王漿液混合，每個濃度梯度設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)。在蜂王出房前1 d取出育王框，并將單個王臺小心取下置于自制王籠中，并一同放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(BINDER)中進(jìn)行孵化(35℃，RH 70%)，每隔1 h觀察蜂王出房情況。

1.3 蜂王外部指標(biāo)測定

培養(yǎng)箱中蜂王出房后立刻用電子天平測定蜂王初生重以及胸重；同時，采用CCD觀察測試系統(tǒng)(江南永新光學(xué)有限公司)測量蜂王胸寬。測定胸重、胸寬的具體試驗(yàn)方法參照胡景華等(2018)的試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 蜂王卵巢管計(jì)數(shù)

解剖蜂王卵巢管時為了便于卵巢管的剝離，蜂王出房后饑餓預(yù)處理(饑餓2～4 h)，消耗掉體內(nèi)脂肪。然后，參考許少玉等(1984)的試驗(yàn)方法對蜂王卵巢管進(jìn)行解剖計(jì)數(shù)。

1.5 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

蜂王出房后在超凈臺中解剖出蜂王卵巢，并參考秦秋紅的試驗(yàn)方法對卵巢進(jìn)行RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(秦秋紅，2013)。熒光定量PCR試驗(yàn)中，Vg、hex110、hex70b基因以及內(nèi)參基因(β-actin)的引物序列均沿用本人前期試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的引物序列(胡景華等，2018)(上海生工合成，表1)。熒光定量PCR反應(yīng)體系(10 μL)：1 μL樣品cDNA，3.0 μL Nuclease-Free Water，上游引物和下游引物各0.4 μL，5 μL SYBR GREENⅡ以及0.2 μL ROX校正液。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃，10 s，58.9℃，1 min(40個PCR循環(huán))；擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后從55℃勻速加熱(每6 s升高1℃)至95℃，建立熔解曲線。每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in real time quantitative PCR

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

Vg、hex110和hex70b基因的表達(dá)量參考Livak等建立的2-ΔΔCt模型進(jìn)行計(jì)算(Livak，2001)。利用StatView軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算蜂王個體外部指標(biāo)以及卵巢管數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲基硬脂酸酯對中蜂蜂王質(zhì)量的影響

2.1.1甲基硬脂酸酯對蜂王個體指標(biāo)的影響

在育王過程中添加不同濃度的甲基硬脂酸酯進(jìn)行處理，結(jié)果表明，0.1%、1.0%和10%濃度的試驗(yàn)組蜂王初生重和胸部指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)；但1.0%和10.0%的試驗(yàn)組，蜂王卵巢管數(shù)明顯下降(P< 0.05)(表2)。

表2 甲基硬脂酸對蜂王個體指標(biāo)的影響Table 2 Effects of MS on the index of queens

2.1.2甲基硬脂酸酯對蜂王卵巢Vg，hex70b和hex110表達(dá)量的影響

在育王過程中添加不同濃度的甲基硬脂酸酯對蜂王卵巢Vg、hex70b和hex110基因表達(dá)均無顯著影響(P>0.05)(圖1)。

圖1 MS對蜂王卵巢Vg (A)、hex70b (B)和hex110 (C)表達(dá)量的影響Fig.1 Effect of MS on the expression level of Vg (A), hex70b (B) and hex110 (C) in queen’s ovary注：圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同小寫字母表示差異顯著(t檢驗(yàn)，P<0.05)。下同。Note: Data are mean±SD, and different lowercases above bars indicate significant difference (t-test, P<0.05). The same below.

2.2 E-β-羅勒烯對中蜂蜂王質(zhì)量的影響

2.2.1E-β-羅勒烯對蜂王個體指標(biāo)的影響

在育王過程中添加E-β-羅勒烯的結(jié)果表明，3個濃度處理組對中蜂蜂王的胸部指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)；但添加10%濃度的E-β-羅勒烯，蜂王初生重顯著增加(P<0.05)；同時，1%和10%濃度E-β-羅勒烯處理可以顯著增加蜂王單側(cè)卵巢管數(shù)(P<0.05)(表3)。

表3 E-β-羅勒烯對蜂王個體指標(biāo)的影響Table 3 Effects of E-beta-ocimene on the index of queens

2.2.2E-β-羅勒烯對蜂王卵巢Vg、hex70b和hex110表達(dá)量的影響

10.0%濃度的E-β-羅勒烯處理組，蜂王卵巢的Vg、hex70b和hex110基因表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)；在1.0%濃度處理組，只有Vg和hex110兩個基因的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；而0.1%濃度處理組，Vg、hex70b和hex110基因表達(dá)量與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 E-β-羅勒烯對蜂王卵巢Vg (A)、hex70b (B)和hex110 (C)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of E-beta-ocimene on the expression level of Vg (A), hex70b (B) and hex110 (C) in queen’s ovary

3 討論與結(jié)論

卵黃原蛋白基因(Vg)的高表達(dá)可以促進(jìn)蜂王卵巢的發(fā)育，并延長蜂王壽命(Engels，1974；Amdametal.，2005；張衛(wèi)星等，2014)。蜂王體內(nèi)Vg表達(dá)量與保幼激素(JHIII)以及昆蟲儲存蛋白基因(hexamerin，hex)的表達(dá)相關(guān)(Coronaetal.，2007；Martinsetal.，2010)。JHIII又與蜜蜂的發(fā)育以及極型分化相關(guān)，而hex為昆蟲從幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)和保障(Burmester & Scheller，1999；Barchuketal.，2007)。研究發(fā)現(xiàn)蜂王幼蟲體內(nèi)JHIII的含量與hex70b和hex110的表達(dá)量呈正相關(guān)(龐倩等，2017a；龐倩等，2017b)，而hex70b以及hex110的表達(dá)水平與昆蟲的性別決定、壽命、免疫力以及繁殖力等生物學(xué)功能相關(guān)(Bitondi，2006；Martinsetal.，2008；Cristinoetal.，2010)。由此可推測Vg、hex70b和hex110基因的表達(dá)與蜂王體內(nèi)JHIII水平相關(guān)并參與調(diào)控蜂王的卵巢發(fā)育，與蜂王的質(zhì)量相關(guān)。

蜂王幼蟲的良好發(fā)育離不開工蜂的積極哺育。早期研究發(fā)現(xiàn)甲基硬脂酸酯作為幼蟲信息素之一，參與調(diào)節(jié)工蜂對幼蟲的哺育行為，西方蜜蜂育王過程中添加甲基硬脂酸酯會促進(jìn)工蜂積極哺育，提高蠟質(zhì)王臺接受率(Le Conteetal.，1995)。那么在中蜂育王過程中添加甲基硬脂酸酯是否也能促進(jìn)工蜂積極哺育，使蜂王幼蟲發(fā)育過程中得到更多的營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高中蜂蜂王的質(zhì)量？本研究利用中華蜜蜂免移蟲育王生產(chǎn)器，在育王過程中添加不同濃度的甲基硬脂酸酯，發(fā)現(xiàn)蜂王初生重、胸重和胸寬等個體指標(biāo)均無顯著差異，1%和10%濃度處理組的單側(cè)卵巢管數(shù)顯著減少，Vg、hex70b和hex110基因表達(dá)量也無顯著差異。由此可見，甲基硬脂酸酯并未能顯著提高中蜂蜂王質(zhì)量，這或許是由于中蜂對甲基硬脂酸酯的反應(yīng)與意蜂有所差異，相關(guān)機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

已有研究表明E-β-羅勒烯作為饑餓信息素的一種成分可以促進(jìn)工蜂吐漿(何旭江等，2016)，而蜂王漿是蜂王及3日齡以內(nèi)幼蟲的主要食物，因此蜂群中E-β-羅勒烯濃度與蜂群食物或營養(yǎng)是否充足有關(guān)。本研究結(jié)果表明，中蜂育王過程中添加10%濃度E-β-羅勒烯可以顯著增加了蜂王初生重和單側(cè)卵巢管數(shù)，而且Vg、hex70b和hex110基因表達(dá)量也顯著升高；添加1%濃度的E-β-羅勒烯可以顯著增加蜂王單側(cè)卵巢管數(shù)以及Vg、hex110兩個基因的表達(dá)量。由此可見，添加一定濃度E-β-羅勒烯可以提高蜂王的生殖潛能，這可能是由于E-β-羅勒烯的添加促進(jìn)了哺育蜂的積極性，對王臺中的幼蟲飼喂更為頻繁，使幼蟲得到更多新鮮的食物，從而培育出更優(yōu)質(zhì)的蜂王。在后續(xù)的研究中，可在育王過程中添加E-β-羅勒烯，進(jìn)一步觀察蜜蜂的哺育行為，并研究王臺中王漿量的變化。

因此，在中蜂育王過程中添加E-β-羅勒烯可以在一定程度上提高蜂王的質(zhì)量，但在實(shí)際生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)效益(產(chǎn)漿量、產(chǎn)蜜量)、抗逆性、日產(chǎn)卵量以及維持蜂群群勢的能力等均有待進(jìn)一步研究。