趙文林，鄒自力，宋佳寶，翟好英

(內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)江 641112)

肝素鈉(Hep)是一種粘多糖類物質(zhì)，是從豬、牛、羊的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的鈉鹽。其作為一種抗凝血藥，具有防止血小板集聚和破壞、抑制纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白單體、抑制凝血活素的形成、對抗已形成的凝血活素、阻止凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶、對抗凝血酶等作用，可用于治療急性血栓栓塞和彌散性血管內(nèi)凝血等疾病[1]。因此，建立對實際樣品中Hep含量測定的方法，對于人體健康具有重要的意義。目前，Hep的測定方法主要有共振散射法[1-3]、分光光度法[4-6]、熒光猝滅法[7]和伏安法[8-9]等。

羅丹明染料是一種堿性呫噸類染料，具有特殊的結(jié)構(gòu)和熒光特性，可廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析[10-11]和生物分析[12]領(lǐng)域。本工作研究發(fā)現(xiàn)，在酸性介質(zhì)中，2種羅丹明染料[羅丹明6G(Rh6G)和丁基羅丹明B(b-RhB)]可通過靜電引力作用分別與Hep形成離子締合物，使2種體系的共振散射(RS)信號顯著增強(qiáng)，且在一定范圍內(nèi)，2種體系的RS信號強(qiáng)度差(ΔIRS)與Hep 質(zhì)量濃度之間均呈線性關(guān)系，但Hep-Rh6G 體系的線性范圍更寬，檢出限更低，據(jù)此，建立了一種Rh6G 共振散射光譜法測定Hep注射液中Hep含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計;p HS-3E型pH 計。

Hep標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取0.025 0 g Hep，用水溶解，配制成100 mg·L－1肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，使用時，用水將此溶液稀釋成10 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

Rh6G 溶液:1.0×10－3mol·L－1。

b-Rh B溶液:1.0×10－3mol·L－1。

三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖溶液:用0.10 mol·L－1HCl溶液將0.10 mol·L－1Tris溶液的酸度調(diào)至pH 5.0。

Britton-Robinson (B-R) 緩沖溶液:將0.040 mol· L－1H3PO4溶液、H3BO3溶液、CH3COOH 溶液混合，用0.20 mol·L－1的Na OH溶液將其酸度調(diào)至pH 5.5。

Hep標(biāo)準(zhǔn)品為生化試劑，其他所用試劑均為分析純;試驗用水均為超純水(電阻率約為18.25 MΩ·cm);肝素鈉注射液(標(biāo)示生物效價12 500 IU/2 mL)，批號分別為51161105 和171007。

1.2 試驗方法

1.2.1 Hep-Rh6G 體系

取Hep注射液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。分取上述溶液1.0 mL 于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度。在10 mL比色管中依次加入Rh6G 溶液0.50 mL、樣品溶液0.25 mL、Tris-HCl緩沖溶液0.50 mL，用水定容至5.0 mL，反應(yīng)10 min。將反應(yīng)后的溶液置于1.0 cm 石英比色皿中，在熒光分光光度計上同步掃描激發(fā)波長(波長范圍為300～500 nm)和發(fā)射波長(波長范圍為300～500 nm)，獲得RS光譜。在377 nm 處分別測量樣品溶液和試劑空白的RS信號強(qiáng)度，分別記為IRS和I0，計算兩者的RS信號強(qiáng)度差ΔI(ΔI＝IRS－I0)來定量分析Hep。

1.2.2 Hep-b-RhB體 系

取Hep注射液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。分取1.0 mL 上述溶液于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度。在10 mL比色管中依次加入b-RhB溶液0.80 mL、樣品溶液0.25 mL、B-R 緩沖溶液0.50 mL，定容至5.0 mL。將反應(yīng)后的溶液置于1.0 cm 石英比色皿中，在熒光分光光度計上同步掃描激發(fā)波長(波長范圍為300～500 nm)和發(fā)射波長(波長范圍為300～500 nm)，獲得RS 光譜。在380 nm 處分別測量樣品溶液和試劑空白RS信號強(qiáng)度，分別記為IRS和I0，計算兩者的RS信號強(qiáng)度差ΔI(ΔI＝IRS－I0)來定量分析Hep。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析波長的選擇

試驗考察了Hep標(biāo)準(zhǔn)溶液用量對Hep-Rh6G和Hep-b-RhB 體系RS 信號強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知:當(dāng)不添加Hep時，Rh6G 在320，377 nm 處有2 個較弱的RS 峰，b-RhB 在333，380 nm 處有2個較弱的散射峰。加入Hep后，2種體系的RS信號增強(qiáng)，且RS 信號均隨體系中Hep標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量的增大而增大，最大散射峰分別位于377，380 nm 處。因此，試驗分別選擇377，380 nm 作為這2種體系的分析波長。

圖1 Hep標(biāo)準(zhǔn)溶液用量對Hep-Rh6G 和Hep-b-RhB體系RS光譜的影響Fig.1 Effect of amount of the Hep standard solution on RS intensity of Hep-Rh6G and Hep-b-RhB systems

2.2 緩沖溶液及其及酸度和用量的選擇

試驗考察了采用HCl 溶液、H2SO4溶液、H3PO4溶液、CH3COONa-CH3COOH 緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、Tris-HCl緩沖溶液和B-R緩沖溶液等7 種反應(yīng)介質(zhì)對Hep-Rh6G 體系和Hep-b-RhB體系的信號強(qiáng)度、靈敏度和線性關(guān)系的影響。結(jié)果表明:以Tris-HCl緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)時，Hep-Rh6G 體系的靈敏度和線性關(guān)系均較好;以B-R 緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)時，Hep-b-Rh B 體系的信號強(qiáng)度及線性關(guān)系均較好。因此，試驗分別選用Tris-HCl緩沖溶液和B-R 緩沖溶液作為Hep-Rh6G 和Hep-b-Rh B體系的反應(yīng)介質(zhì)，并考察了這2種緩沖溶液的酸度和用量對Hep-Rh6G 體系和Hep-b-RhB體系RS強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 緩沖溶液的酸度和用量對Hep-Rh6G 體系和Hep-b-RhB體系RS強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of acidity and amount of the buffer solution on RSintensity of Hep-Rh6G and Hep-b-RhB systems

由圖2 可以看出:在Hep-Rh6G 體系中，pH 5.0時，ΔI最大;在Hep-b-RhB體系中，pH 5.5時，ΔI最大，故Hep-Rh6G 體系選取pH 5.0 Tris-HCl緩沖溶液，Hep-b-Rh B 體系選取pH 5.5 B-R 緩沖溶液。在Hep-Rh6G 體系中，當(dāng)緩沖溶液用量為0.50 mL時，ΔI最大;在Hep-b-RhB 體系中，當(dāng)緩沖溶液用量為0.10～0.50 mL時，ΔI較大且基本不變。綜合考慮，試驗選擇這2種體系所用的緩沖溶液用量均為0.50 mL。

2.3 各試劑加入順序的選擇

試驗考察了2 種羅丹明染料(Rh6G/b-RhB)、Hep和緩沖溶液等3種試劑的6種加入順序?qū)?種體系靈敏度和線性關(guān)系的影響。結(jié)果表明:當(dāng)采用染料(Rh6G/b-RhB)、Hep、緩沖溶液的加入順序時，2種體系均有較好的靈敏度和線性關(guān)系。

2.4 羅丹明染料用量的選擇

試驗考察了2 種羅丹明染料的用量對各體系RS信號強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3 可以看出:在Hep-Rh6G 體系中，當(dāng)Rh6G 溶液用量為0.50 mL 時，ΔI最大;在Hep-b-Rh B體系中，當(dāng)b-RhB溶液用量為0.80 mL 時，ΔI最大。故試驗選擇2 種體系中Rh6G 和b-RhB 溶液的用量分別為0.50，0.80 mL。

圖3 羅丹明染料的用量對RS信號強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of amount of the rhodamine dye on RS intensity

2.5 穩(wěn)定性試驗

按照試驗方法進(jìn)行穩(wěn)定性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種體系的反應(yīng)速率均較快，Hep-Rh6G 體系在10 min內(nèi)反應(yīng)完全，Hep-b-RhB體系在2 min內(nèi)基本反應(yīng)完全;且2種體系在1.0 h 內(nèi)，RS 信號基本保持不變，說明這2種體系穩(wěn)定性均較好。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗方法分別對Hep-Rh6G 體系中的0.020，0.10，0.20，0.40，0.60，1.0，1.6，2.0 mg·L－1Hep標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和Hep-b-Rh B 體系中的0.10，0.20，0.40，0.60，1.0，1.6 mg·L－1Hep標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以Hep的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的ΔI為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2種體系的線性參數(shù)見表1。

對試劑空白進(jìn)行11次平行測定，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差s，根據(jù)3s和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k)，結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

由表1可以看出:Hep-Rh6G 體系的線性范圍更寬、線性關(guān)系更優(yōu)、檢出限更低。因此，試驗選擇Hep-Rh6G 體系對Hep注射液中的Hep含量進(jìn)行測定。

2.7 共存物質(zhì)的干擾

試驗考察了30種可能共存的物質(zhì)對采用Hep-Rh6G 體系測定1.0 mg·L－1Hep 標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響。當(dāng)相對誤差小于±5%時，30種共存物質(zhì)的允許倍數(shù)見表2，其中，“?”用0.10 mol·L－1NaF溶液掩蔽。

表2 共存物質(zhì)的影響Tab.2 The effect of coexisting substances

2.8 樣品分析

按照Hep-Rh6G 體系的試驗方法對2 個批次的Hep注射液樣品進(jìn)行測定，并以此為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每個樣品平行測定5次，計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率。樣品分析結(jié)果見表3。

表3 樣品分析結(jié)果(n＝5)Tab.3 Analytical results of the samples(n＝5)

由表3可知:2個批次的Hep注射液中Hep的回收率分別為96.0%，101%，測定值的RSD 分別為4.9%，3.9%。經(jīng)換算，得51161105和171007兩個批號樣品的生物效價分別為13 165 IU/2 mL 和13 720 IU/2 mL，與標(biāo)示生物效價的相對誤差依次為5.32%，9.76%。

本工作發(fā)現(xiàn)，Hep可以增強(qiáng)Rh6G 和b-Rh B的RS信號強(qiáng)度，在優(yōu)化的試驗條件下，最終確定采用Hep-Rh6G 體系測定Hep注射液中Hep的含量，該方法精密度和準(zhǔn)確度都較好，可作為熒光光譜探針測定實際樣品中Hep含量。