羅哌卡因經(jīng)原癌基因信號通路抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制

洪 勇，周民偉，徐化交

0 引 言

化療是胃癌最常用的治療方法，但5-氟尿嘧啶、順鉑、阿霉素等多數(shù)化療藥物療效不滿意，不良反應(yīng)嚴(yán)重[1-2]。因此，迫切需要尋找新效藥物以提高胃癌的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有影響人癌細(xì)胞侵襲的能力[3]。在直結(jié)腸癌細(xì)胞中，羅哌卡因通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和MMP-9的表達(dá)，在體外抑制細(xì)胞的侵襲和遷移[4]。此外，持續(xù)輸注羅哌卡因還可抑制小鼠骨肉瘤LM8細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移[5]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑在癌癥化療中的作用受到研究者的關(guān)注。PKC在腫瘤增殖和生存過程中發(fā)揮作用，它也被認(rèn)為具有致癌活性[6]。原癌基因(proto-oncogene，c-MYC)是PKC通路的下游靶基因之一，參與細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞生長、分化、代謝和凋亡的基因的主要調(diào)控因子，也是一種有效的細(xì)胞致癌基因，在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)其異常[7]。因此，在本研究探討羅哌卡因?qū)ξ赴㎝GC-803細(xì)胞增殖、遷移的影響，并探討其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器主要試劑：羅哌卡因(瑞典AstraZeneca AB公司，批號:6903065.77)；順鉑(美國sigma公司，批號：P4394)；人胃癌MGC-803細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國HyClone公司)；青鏈霉素溶液(美國Corning公司)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8 (cell count kit 8，CCK-8)(美國Amresco公司，規(guī)格：96T)；細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；PKC、c-MYC、MMP-9、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target of rapamycin，mTOR)和β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠IgG二抗(武漢艾美捷科技有限公司)。主要儀器：Multiskall MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Ther-mo Revco公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；BD垂直電泳儀(美國BD公司)；凝膠成像儀(美國UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組用含胎牛血清(10%)和50 U/mL青鏈霉素(50 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。實(shí)驗分為對照組、羅哌卡因低劑量組、羅哌卡因中劑量組、羅哌卡因高劑量組和順鉑組。對照組無處理，羅哌卡因低、中、高劑量組分別給予終濃度為100、200、400 μg/mL的羅哌卡因[8]，順鉑組給予終濃度為10 mmol/mL的順鉑[9]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率以5×103/孔接種于96孔板中(200 μL/孔)，待細(xì)胞融合后，按1.2.1給予受試物干預(yù)20 h，繼續(xù)培養(yǎng)20 h，向培養(yǎng)板中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在630 nm處測定吸光度值，細(xì)胞增殖率計算公式如下：

細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)

1.2.3 細(xì)胞劃痕法檢測MGC-803細(xì)胞遷移能力以5×104/孔接種于6孔板中(2 mL/孔)，待細(xì)胞融合，用100 μL滅菌槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次，按1.2.1給予受試物干預(yù)24 h后，用顯微鏡下拍照，用圖像分析儀測量測量劃痕寬度。

1.2.4 Western blot法檢測PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表達(dá)以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)(3 mL/孔)，待細(xì)胞融合加入按1.2.1分組分別處理MGC-803細(xì)胞24 h，收獲細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞量加入細(xì)胞蛋白抽提液，進(jìn)行電泳(每孔上樣量為20 μg)，將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與PKC(1∶200)、c-MYC(1∶100)、MMP-9(1∶400)、PI3K(1∶300)、AKT(1∶400)、mTOR(1∶200)和β-actin(1∶1000)抗體進(jìn)行孵育，4 ℃過夜，用TBST緩沖液對膜進(jìn)行2次沖洗，將二抗(1∶5000)在室溫下孵育30 min。進(jìn)行顯色，采集圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 羅哌卡因?qū)GC-803細(xì)胞增殖和遷移能力的影響與對照組比較，各羅哌卡因劑量組和順鉑組MGC-803細(xì)胞增殖率和遷移能力降低，且各羅哌卡因劑量組降低強(qiáng)度呈劑量依賴性，但細(xì)胞增殖率和遷移能力仍高于順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1、圖2。

表1 羅哌卡因?qū)GC-803細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

a:對照組;b-d:分別為羅哌卡因低劑量、中劑量、高劑量組;e:順鉑組圖示隨著羅哌卡因劑量的增加，細(xì)胞增殖率降低圖1 羅哌卡因?qū)GC-803細(xì)胞增殖影響的透射電鏡圖( ×3000)

a:對照組;b-d:分別為羅哌卡因低劑量、中劑量、高劑量組;e:順鉑組圖示隨著羅哌卡因劑量的增加，細(xì)胞遷移能力降低圖2 羅哌卡因?qū)GC-803細(xì)胞遷移能力影響的劃痕實(shí)驗結(jié)果( ×200)

2.2 羅哌卡因?qū)GC-803細(xì)胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表達(dá)的影響與對照組比較，各羅哌卡因劑量組和順鉑組MGC-803細(xì)胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表達(dá)均降低，且各羅哌卡因劑量組降低強(qiáng)度呈劑量依賴性，但各指標(biāo)表達(dá)仍高于順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖3。

表2 羅哌卡因?qū)GC-803細(xì)胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表達(dá)的影響

1:對照組;2-4分別為：羅哌卡因低劑量、中劑量、高劑量組;5:順鉑組圖3 羅哌卡因?qū)GC-803細(xì)胞中PKC、c-MYC、MMP-9、PI3K、AKT和mTOR表達(dá)影響的電泳圖

3 討 論

既往大量報道顯示，羅哌卡因?qū)Π┌Y具有一定的治療作用，且其安全性令人滿意[10]。為了進(jìn)一步了解羅哌卡因?qū)ξ赴┑姆肿訖C(jī)制，本研究進(jìn)行了一系列的體外實(shí)驗。通過CCK-8檢測結(jié)果可以看出，羅哌卡因?qū)ξ赴㎝GC-803細(xì)胞有生長抑制作用。

轉(zhuǎn)移是癌癥的標(biāo)志之一，抑制轉(zhuǎn)移已成為治療癌癥的有吸引力的治療選擇。 在轉(zhuǎn)移中，細(xì)胞遷移是關(guān)鍵步驟。最近的報告顯示，羅哌卡因既可以起到抗腫瘤作用，又可以起到抗血管生成作用[11]。有研究顯示，羅哌卡因降低了人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞中MMP-9的水平[12]。本研究結(jié)果表明，羅哌卡因抑制人胃癌細(xì)胞的遷移，并與抑制MMP-9的表達(dá)有關(guān)，從而擴(kuò)大了羅哌卡因的生物活性。在此，本研究證實(shí)了羅哌卡因通過c-MYC信號通路在體外抑制細(xì)胞的增殖和遷移。

羅哌卡因除了體外抑制細(xì)胞的增殖和遷移，本研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因降低了PKC水平。這些數(shù)據(jù)表明，PKC是羅哌卡因的抗腫瘤作用的主要關(guān)鍵目標(biāo)。為了進(jìn)一步驗證這一假設(shè)，本研究檢測了c-MYC水平的變化。原癌基因PKC的致癌途徑與下游c-MYC表達(dá)增加相關(guān)聯(lián)[13]。c-MYC是人類癌癥中最普遍的致癌基因之一，在約50%的腫瘤中被失調(diào)，尤其是在淋巴瘤中，并且還存在于子宮頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌中[14]。盡管有一些研究報道c-MYC的陽性表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)，如食管鱗狀細(xì)胞癌樣品中存在c-MYC過表達(dá)，并且c-MYC mRNA的水平是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素，是食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存的指標(biāo)，但其潛在機(jī)制尚未得到很好的了解[15]。研究顯示，c-MYC是細(xì)胞生長的重要調(diào)控因子，并在多種細(xì)胞類型中響應(yīng)生長促進(jìn)因子而被激活[16]。癌基因表達(dá)的變化在細(xì)胞癌變和逆轉(zhuǎn)運(yùn)動中起重要作用，相關(guān)基因的擴(kuò)增和失活是人胃癌細(xì)胞的主要指標(biāo)。因此，c-MYC基因表達(dá)的改變是細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖的重要事件。PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由PI3K、Akt和mTOR三個蛋白酶組成。PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可通過多種刺激抑制凋亡的觸發(fā)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展、存活和增殖[17]。此外，PI3K/Akt/mTOR信號通路還具有多種功能，包括參與血管生成、惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥，以及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[18]。研究顯示，羅哌卡因通過PI3K/Akt/mTOR誘導(dǎo)人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬并抑制血管生成能力，而過表達(dá)c-MYC可顯著增加黑色素瘤B16F10細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)羅哌卡因的加入明顯抑制了c-MYC的表達(dá)，從而抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活。因此，c-MYC可能成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究顯示羅哌卡因通過抑制c-MYC信號通路在體外抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和遷移。這些結(jié)果突出了羅哌卡因作為抗增殖和抗遷移劑的重要性，并可能提供抗胃癌的治療潛力，但其作為臨床治療藥物還要大量的研究進(jìn)行論證。