白頭翁湯對痢疾桿菌的體外抑菌作用研究

王麗，陶興寶，歐陽凈，楊鐘平

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心，重慶 400036)

痢疾桿菌(Shigella dysenteriae)又稱志賀氏菌，為革蘭氏陰性菌，無芽孢、無鞭毛，耐寒?？梢栽谄胀ㄅ囵B(yǎng)基上生長，形成中等大小、半透明的光滑菌落[1]。痢疾桿菌是導(dǎo)致人類及靈長類動物感染細菌性痢疾最為常見的病原菌，感染之后會出現(xiàn)以腹痛、腹瀉、發(fā)熱為特征的典型癥狀[2]。細菌性痢疾在我國被劃歸為乙類傳染病，根據(jù)衛(wèi)生部《全國細菌性痢疾監(jiān)測方案》中報道，全球每年感染人次約為1.65億，發(fā)達國家細菌性痢疾發(fā)病率約為1.8～6.5/10萬，我國發(fā)病率為15.29/10萬[3],明顯高于其他發(fā)達國家。隨著抗菌藥物的廣泛使用，痢疾桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性大幅提高，細菌性痢疾的防治日趨困難。我國傳統(tǒng)的中草藥價格低廉、毒副作用小、耐藥性低，越來越多的國內(nèi)外研究者從中草藥中篩選抗菌藥物，探究其抑菌作用[4]。本文主要對白頭翁湯對痢疾桿菌體外抑菌效果進行研究，旨在為防治細菌性痢疾提供用藥參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和菌株來源

白頭翁、黃連、黃柏和秦皮購置于本院中藥房。痢疾桿菌由本院微生物實驗室提供。

1.1.2 主要儀器和試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、無菌操作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、紫外分光光度計、電導(dǎo)率儀等。主要試劑：蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、氯化鈉、蒸餾水等，由本院微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)基的制備

液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.4。固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，瓊脂18 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH值至7.4。

1.2.2 白頭翁湯水相提取物的制備

稱取白頭翁150 g,黃柏120 g,黃連60 g和秦皮120 g加10倍蒸餾水于圓底燒瓶中，浸泡60 min后加熱回流60 min，用紗布趁熱過濾。藥渣再分別加入8倍量蒸餾水和6倍量蒸餾水重復(fù)上述操作，合并濾液，減壓濃縮成生藥濃度為0.1 g/mL的藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 痢疾桿菌懸液的制備

在37 ℃條件下將痢疾桿菌菌種于24 h內(nèi)反復(fù)活化3代，用血球計數(shù)板計數(shù)。加入液體培養(yǎng)基稀釋制成含菌量為106cfu/mL的菌懸液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定

將試管按順序編號后置于試管架上，每管內(nèi)加入2.0 mL無菌液體培養(yǎng)基，然后在第1管中加入2.0 mL滅菌的白頭翁水提取物，混合均勻后取出2.0 mL加入第2管中，重復(fù)前述操作，直至第7管中取出2.0 mL液體丟棄，第8管作為陽性對照，不加入藥液，以觀察培養(yǎng)基是否適宜細菌生長。第9管中不加菌液，加入2.0 mL白頭翁水提取物，作為陰性對照，以觀察受試藥液是否被污染。1～7號試管藥液濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2 mg/mL、陽性對照和陰性對照。然后向1～8號試管中分別加入0.1 mL痢疾桿菌菌懸液，混合均勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。如肉湯混濁，則表示細菌生長，如肉湯完全清亮，則表示無細菌生長。以無細菌生長的最低藥液濃度作為白頭翁湯對痢疾桿菌的MIC。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測定

吸取0.1 mL無細菌生長的各試管中培養(yǎng)液，接種到無藥液的瓊脂培養(yǎng)基上，輕輕推開，于37 ℃下培養(yǎng)。觀察細菌生長情況，培養(yǎng)基中無細菌生長的最低藥物濃度為白頭翁湯的MBC。

1.2.6 白頭翁湯作用下細菌細胞膜電導(dǎo)率的測定

將痢疾桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后接種到液體培養(yǎng)基中，并加入稀釋后的白頭翁湯水相提取物，使終濃度分別為32、64 mg/mL，此為實驗組。對照組1為不加乙醇的溶液，對照組2為添加等體積乙醇的溶液。實驗組和對照組分別搖床培養(yǎng)，在0，2，4，6，8 h取菌液，在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min下離心10 min，取其上清液，并用去離子水稀釋20倍，測定稀釋后的上清液電導(dǎo)率。實驗重復(fù)3次，取平均值[6]。

1.2.7 細菌DNA含量檢測

將痢疾桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后接種到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液中白頭翁湯的終濃度為2，4，6，8，16 mg/mL，選擇無菌水為空白對照組，于37 ℃、130 rpm搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后分別取樣品2 mL，轉(zhuǎn)速為4 000 rpm條件下離心10 min，取上清液。用紫外分光光度計測上清液中DNA大分子的吸光度。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.8 對蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的影響

將2.5 mL Tris-HC(0.1 mol/L,pH值8.8)、0.1 mL蘋果酸鈉(0.1 mmol/L)、0.1 mL輔酶Ⅰ(10 mmol/L)依次加入石英比色皿中，快速加入粗酶液0.3 mL，引發(fā)反應(yīng)。在340 nm波長下，每隔0.5 min用紫外可見分光光度計測定,連續(xù)3 min，以時間t(min)為橫坐標(biāo)、A340 nm為縱坐標(biāo)作圖，取整個反應(yīng)過程中的線性部分來計算A340 nm/min的增殖，以每min A值增加0.01作為1個酶活力單位。用小牛血清蛋白對照，測定粗酶液中MDH的含量，按照公式求出MDH的比活性;SDH活性按試劑盒的操作步驟進測定。以小血清蛋白為對照，測定粗酶液中SDH的含量，按照公式求出SDH的比活性[7]。

MDH的比活性[U/(min·mg)]=(ΔA/0.01)/(反應(yīng)時間×樣品蛋白含量)

SDH比活性(U/mg)=酶活性/樣品蛋白含量

2 結(jié)果

2.1 白頭翁湯的最小抑菌濃度(MIC) 和最低殺菌濃度(MBC)

將體外抑菌及最小抑菌濃度的測定時間分別設(shè)為12 h和24 h， 利用白頭翁湯水提取物的母液，分別將白頭翁湯水提物稀釋到2、4、6、8、16、32、64、128 mg/mL等梯度濃度，觀察白頭翁湯水提取物對痢疾桿菌的抑制作用，結(jié)果顯示，其最小抑菌濃度MIC大概為32 mg/mL，重復(fù)實驗3次，結(jié)果相同。參考五倍子、金銀花、穿心蓮等中藥的MIC在125以上，表明白頭翁湯水提物對痢疾桿菌具有較好的抑菌作用。結(jié)果見表1。

表1 白頭翁湯提取物對痢疾桿菌MIC測定結(jié)果

進一步利用白頭翁湯水相提取物的母液，分別將白頭翁湯水相提取物稀釋到2、4、6、8、16、32、64、128 mg/mL等梯度濃度，觀察白頭翁湯水提取物對痢疾桿菌的殺菌作用，結(jié)果顯示，其最小殺菌濃度MBC大概為64 mg/mL，重復(fù)實驗3次，結(jié)果相同。參考五倍子、金銀花、穿心蓮等中藥的MBC在220以上，表明白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌具有較好的殺菌作用。結(jié)果見表2。

表2 白頭翁湯提取物對痢疾桿菌MBC測定

2.2 白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌生長曲線的影響

為了進一步明確白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌的影響，采取梯度濃度殺菌/抑菌檢測法對白頭翁湯的作用進行了研究，結(jié)果顯示，陰性對照(即不加白頭翁湯)對痢疾桿菌生長無作用，細菌出現(xiàn)了明顯的指數(shù)級增長，采取MIC濃度的白頭翁湯作用后(即32 mg/mL)，痢疾桿菌的生長曲線出現(xiàn)了明顯的抑制；采取MBC濃度的白頭翁湯作用后(即64 mg/mL)，痢疾桿菌出現(xiàn)了明顯的殺滅效應(yīng)，而且效應(yīng)存在明顯的時間梯度依賴性。這一結(jié)果表明，白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌具有良好的抑菌和殺菌作用。見圖1。

圖1 白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌的殺菌/抑菌曲線

2.3 測定細菌細胞膜的電導(dǎo)率

細菌的細胞膜結(jié)構(gòu)為細胞的生命活動提供了相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時參與細胞與周圍環(huán)境中的物質(zhì)交換，保持細胞內(nèi)外滲透壓的平衡。添加藥物會對細胞膜的滲透性產(chǎn)生一定影響，表現(xiàn)為培養(yǎng)基電導(dǎo)率的改變。研究顯示，與對照組相比，白頭翁湯組隨著作用時間延長及溶液濃度增加，電導(dǎo)率也顯著增加，由此可見細菌體內(nèi)有電解質(zhì)滲出，表明白頭翁湯可能破壞痢疾桿菌的細胞膜和細胞壁，從而抑制其生長。見圖2。

圖2 白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌電導(dǎo)率的影響

2.4 白頭翁湯作用痢疾桿菌后DNA含量的變化

細菌DNA含量是評價細菌活性和致病力的重要指標(biāo)，筆者利用白頭翁湯水相提取物的母液，分別將白頭翁湯水相提取物稀釋到2、4、6、8、16 mg/mL等梯度濃度，觀察白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌DNA含量的影響，OD值測定結(jié)果顯示，隨著濃度梯度的增高，痢疾桿菌DNA含量逐漸降低，并呈現(xiàn)出濃度依賴性，這一結(jié)果表明，白頭翁湯水相提取物可以明顯降低痢疾桿菌DNA含量。見圖3。

圖3 白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌DNA含量的影響

2.5 白頭翁湯對蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的影響

蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)是呼吸代謝中的關(guān)鍵酶，MDH和SDH的活性強弱可反映對細菌呼吸代謝的影響，研究結(jié)果見圖4及圖5。由圖可見，在不同時間段，實驗組MDH、SDH的比活性均明顯低于空白組，但不同濃度組的比活性無明顯變化。以上結(jié)果表明，白頭翁湯提取物可以降低痢疾桿菌的蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性，影響細胞的呼吸代謝，從而影響細菌的正常繁殖。

圖4 白頭翁湯對蘋果酸脫氫酶(MDH)活性的影響

圖5 白頭翁湯對琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的影響

3 討論

白頭翁湯其組方及煎服法：白頭翁二兩，黃連(去須)三兩，黃柏(去皮)三兩，秦皮三兩，上四味，以水七升，煮取二升，去滓溫服一升，不愈更服一升。該方組方嚴謹，具有清熱解毒、涼血止痢等作用，主治濕熱諸疾。方中白頭翁為君，清熱解毒、涼血止痢；黃連、黃柏、秦皮為臣，清熱燥濕、瀉火解毒。四藥并用，可以加強清熱止痢之功，為熱毒血痢之良方，在臨床中應(yīng)用非常廣泛[8]。目前該方臨床主要用于治療細菌性痢疾、阿米巴痢疾等癥，尤其對于細菌性痢疾該方常作為治療的首選方劑[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白頭翁湯劑對細菌有明顯抑制作用,能殺滅阿米巴原蟲和陰道滴蟲。故可用于相關(guān)感染性疾病的治療，如細菌性痢疾、阿米巴痢疾、滴蟲性陰道炎、泌尿道感染、阿米巴肝膿瘍、急慢性盆腔炎、霉菌等[8]。

細菌性痢疾是痢疾桿菌引起的腸道傳染病。痢疾桿菌經(jīng)消化道感染人體后，引起結(jié)腸黏膜的炎癥和潰瘍，并釋放毒素入血，使感染者出現(xiàn)腹瀉、腹痛、里急后重的癥狀，該疾病在夏秋季發(fā)病率較高[10]，是我國的常見病、多發(fā)病，兒童和青壯年是高發(fā)人群。近年來，國家不斷加大對衛(wèi)生投入，以及抗菌藥物的廣泛使用，細菌性痢疾發(fā)病率和病死率都明顯下降。但由于抗菌藥物的濫用，耐藥菌不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致該病發(fā)病率仍然處于較高水平，并且常有局部暴發(fā)流行的報道，給該病的防控及治療帶來了挑戰(zhàn)。臨床中常采用白頭翁湯通過抑制痢疾桿菌治療細菌性痢疾，療效顯著，作用可靠，對縮短病程，控制傳染源，減少細菌性痢疾的發(fā)生具有重要意義。

目前的研究表明，中醫(yī)藥抑菌作用機制一般為改變細菌細胞膜、細胞壁通透性，通過抑制蛋白質(zhì)、核酸表達及三羧酸循環(huán)，從而擾亂菌體生理代謝而實現(xiàn)抑菌或殺菌[11]。Yang等[12]通過阻滯凝膠電泳和原子力顯微鏡分析枯草芽孢桿菌DNA 與10-HAD的結(jié)合，探究10-HAD抑制枯草芽孢桿菌的抑菌機制，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌的DNA與10-HAD有很強的結(jié)合力。Li等[13]通過流式檢測P7對大腸桿菌細胞周期的影響，研究其對大腸桿菌抑菌機制，結(jié)果顯示P7可阻滯大腸桿菌細胞周期的S期，使細胞周期發(fā)生紊亂，從而達到抑菌作用。Dwyer等[14]研究發(fā)現(xiàn)抗生素能夠使細菌發(fā)生生理性細胞凋亡，其作用機制可能為抗生素作用菌體后使活性氧含量急劇上升。Dorsey-Oresto等[15]的研究表明，抑菌劑可以抑制Yih E基因的表達實現(xiàn)對細菌的抑制作用。

本研究對白頭翁湯的抑菌機制進行了初步探討，但其在人體中的作用如何，還需要新一步的動物實驗和臨床實驗來證明。另外，筆者研究主要是針對白頭翁湯水相提取物，至于白頭翁其他溶液相的作用如何，比如正丁醇、乙醚等有機相的作用和效果如何，是否比水相具有更好的效果，尚需要進一步的研究證實。

4 結(jié)論

本研究表明，白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌有一定程度的抑菌和殺菌作用，白頭翁湯水相提取物可能破壞痢疾桿菌的細胞膜和細胞壁，從而抑制痢疾桿菌生長，其抑菌作用隨著水相提取物濃度的增加、以及作用時間的延長而增強。即白頭翁湯水相提取物對痢疾桿菌的抑制作用有著濃度和時間依賴性。白頭翁湯也可通過降低痢疾桿菌DNA含量而達到抑菌作用。另一方面，白頭翁湯水相提取物還可通過影響呼吸作用的關(guān)鍵酶比如蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)來調(diào)控痢疾桿菌的生存或者死亡。