夏丹丹，趙瑩瑩，馬盼盼，王深壘，馬常陽(yáng),3，郜曉峰,，康文藝,3,

（1.河南大學(xué) 國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南 開封 475004；2.河南省藥食兩用資源功能研究國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004；3.開封市保健食品功效成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004）

枸杞子（Lycium barbarumL.）是茄科枸杞屬植物的干燥成熟果實(shí)[1]，具有抗氧化、控制血糖、養(yǎng)肝明目、提高免疫力等多種功效[2-4]，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用食物。枸杞子糖分含量很高，多糖是它主要的功能成分[5]，占比約為3.36%[6]。所以枸杞子易泛油，一旦貯存不當(dāng)很容易腐爛、蟲蛀甚至被微生物污染，目前，對(duì)枸杞子的微生物污染情況研究不夠深入[7]。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是最為常見的食源性微生物之一[8]。大腸桿菌中常見的毒力基因有志賀樣毒素基因（stx1和stx2）、緊密素（eae）、溶血素基因（hly）、O抗原編碼基因（rfb）、β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uid）和鞭毛抗原基因（fli）[9-12]。目前對(duì)于大腸桿菌的檢測(cè)從傳統(tǒng)方法到包括常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR[13-14]的分子生物學(xué)技術(shù)、DNA微陣列技術(shù)[15]、免疫檢測(cè)技術(shù)[16]、傳感器芯片技術(shù)[17]和質(zhì)譜技術(shù)[18]。這些方法基于相應(yīng)的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。由于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品具備穩(wěn)定性好、純度高等優(yōu)點(diǎn)[19-21]，常常用于臨床應(yīng)用檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照品。由于缺少大腸埃希氏菌毒力基因監(jiān)測(cè)相關(guān)質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品[22]，參考物質(zhì)溯源性不強(qiáng)、不確定度高、評(píng)價(jià)模式單一等嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致各檢測(cè)機(jī)構(gòu)之間的檢測(cè)結(jié)果差異極大，無(wú)法為食品檢驗(yàn)數(shù)據(jù)提供技術(shù)保障。

本研究針對(duì)目前相關(guān)領(lǐng)域急需，構(gòu)建大腸桿菌毒力基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，保證大腸桿菌關(guān)方法檢測(cè)結(jié)果的可比性，并以藥食兩用食物枸杞子為研究目標(biāo)，快速檢測(cè)大腸桿菌污染情況，以期為食品中大腸桿菌的快速檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

34 批枸杞子樣品購(gòu)于2018年1月，存放于河南大學(xué)國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心。

大腸桿菌（O157、CMCC 43201、CICC 10372、ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（CICC 23656）、阪崎腸桿菌（CICC 21560）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、單核細(xì)胞性李斯特菌（ATCC 19115）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院于2018年5月贈(zèng)送，并貯存于河南大學(xué)國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心。本研究中選擇CICC為基因組提供菌。

瓊脂糖 東格生物技術(shù)有限公司；6×DNA loading Buffer、GoldView I型核酸染色劑、氨芐青霉素 美國(guó)Solarbio公司；瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；D2000 DNA Marker、Marker III、感受態(tài)細(xì)胞（DH-5a）、2×Pfu PCR Master Mix（KP201）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）、pLB零背景快速克隆試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒（DP105）、土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336） 天根生化科技有限公司；pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 青島賓得生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀、Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)、臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司；超凈工作臺(tái)蘇潔凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱 泰宏醫(yī)療器械有限公司；JUNYI脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、BIS910凝膠成像系統(tǒng) 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌PCR檢測(cè)方法的建立和評(píng)價(jià)

取大腸桿菌菌液1 mL，12 000 r/min，4 ℃離心2 min，棄上清液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取大腸桿菌基因組DNA。對(duì)大腸桿菌中毒力基因escV、stx2和hlyA進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化，并對(duì)所建立的PCR反應(yīng)進(jìn)行特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)。用金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌和單核細(xì)胞性李斯特菌進(jìn)行引物特異性實(shí)驗(yàn)。將提取的大腸桿菌全基因組DNA進(jìn)行10 倍梯度倍比稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列濃度，進(jìn)行檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)，將同一批不同稀釋度的稀釋液按建立的方法進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析此方法的重復(fù)性。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小Table 1Primer sequences and PCR-amplified product sizes

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證

利用建立的PCR反應(yīng)擴(kuò)增大腸桿菌的毒力基因，得到目的條帶后，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收。使用pLB零背景快速克隆試劑盒將大腸桿菌毒力基因escV、stx2、bfpA純化后的PCR產(chǎn)物連接至pLB-simple Vector上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)重組大腸桿菌，挑取單菌落經(jīng)菌落PCR、并送往華大生物科技有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序進(jìn)行鑒定，對(duì)測(cè)序結(jié)果采用BLAST進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的是否正確。經(jīng)篩選連接轉(zhuǎn)化成功后的重組子繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)15 代，并進(jìn)行送檢測(cè)序驗(yàn)證傳代過(guò)程中質(zhì)粒是否丟失。

1.3.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉的制備

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品雖然具有性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但其在長(zhǎng)期貯存過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)染菌，貯存不方便等問題，考慮到這方面，本研究將制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行凍干粉制備，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備成無(wú)菌粉末劑型，貯存在EP管中，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)凍干之后，使用時(shí)再將凍干粉溶解，不僅減少了染菌的幾率，其穩(wěn)定性也更高，貯存起來(lái)也更方便。本研究也對(duì)制備的凍干粉進(jìn)行了檢測(cè)限研究、均勻性研究以及短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究。

將escV、stx2、hlyA重組質(zhì)粒進(jìn)行凍干粉制備和應(yīng)用，選擇經(jīng)篩選成功的escV、stx2、hlyA陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，采用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒大提用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉的制備，使用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取質(zhì)粒的濃度和純度，然后送公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功后進(jìn)行凍干粉的制備，用EP管貯存，制成質(zhì)量400 ng左右的凍干粉，分別制備150 管。

1.3.4 均勻性分析

在制備的150 管凍干粉中隨機(jī)挑選15 管，用10 μL ddH2O溶解，進(jìn)行各管之間的均一性研究。使用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，分別測(cè)定3 次，取其平均值，用F檢驗(yàn)[24]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.5 穩(wěn)定性分析

1.3.5.1 短期穩(wěn)定性

隨機(jī)取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉置于25、4、-20 ℃ 3 個(gè)溫度下2 周進(jìn)行短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，第1、3、7、14天進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)各取3 管，用10 μL ddH2O溶解，用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，另取溶解后的escV、stx2、hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別對(duì)escV、stx2、hlyA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行定性分析，考察凍干粉的短期穩(wěn)定性。

1.3.5.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

隨機(jī)取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉置于25、4、-20 ℃ 3 個(gè)溫度下5 個(gè)月進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)月進(jìn)行一次檢測(cè)。每次檢測(cè)各取3 管，用10 μL ddH2O溶解，用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和PCR擴(kuò)增來(lái)考察凍干粉的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

1.3.6 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)

將提取的escV、stx2、hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度先50 倍稀釋后，作為初始檢測(cè)樣品，進(jìn)行稀釋后得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列濃度梯度，進(jìn)行檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)，確定escV、stx2、bfpA、hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限。將escV、stx2和hlyA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度按照下式換算為拷貝數(shù)：

DNA長(zhǎng)度=載體長(zhǎng)度＋目的基因長(zhǎng)度

1.3.7 質(zhì)粒凍干粉在枸杞子檢測(cè)中的應(yīng)用

樣品制備：稱取25 g枸杞樣本加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液225 mL，振蕩30 min，超聲處理10 min。收集液體6 000 r/min離心10 min，取沉淀，用于DNA提取。使用土壤基因組DNA提取試劑盒提取枸杞樣品的微生物基因組DNA，將提取的枸杞樣品DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，進(jìn)行毒力基因escV、stx2、hlyA的檢測(cè)。對(duì)于PCR檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性的枸杞樣品進(jìn)行傳統(tǒng)微生物分離純化檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)方法的建立和評(píng)價(jià)結(jié)果

表2 基因組DNA質(zhì)量濃度和純度Table 2 Concentration and purity of genomic DNA

通過(guò)使用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)，測(cè)定提取的大腸桿菌全基因質(zhì)量DNA質(zhì)量濃度和純度，結(jié)果如表2所示。提取的大腸桿菌DNA質(zhì)量濃度在50～100 ng/μL之間，A260nm/A280nm也可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。如圖1所示，可以觀察到單一清晰的特異性條帶，無(wú)雜帶，條帶較亮，說(shuō)明提取的DNA純度和濃度較好，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 大腸桿菌全基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of E.coli whole genomic DNA

優(yōu)化后的25 μL PCR反應(yīng)體系為2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL（＜1 μg/μL），上、下游引物0.25 μL（10 μmol/L），加雙蒸水至25 μL。escV和stx2擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。hlyA擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

大腸桿菌escV、stx2和hlyA引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些引物具有特異性，結(jié)果如圖2所示。建立的PCR檢測(cè)方法可使大腸桿菌的檢出限達(dá)到pg水平，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無(wú)差異，該P(yáng)CR檢測(cè)方法重復(fù)性滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 大腸桿菌escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）引物特異性結(jié)果Fig.2 Primer specificity of escV (A), stx2 (B), and hlyA (C) in E.coli

圖3 大腸桿菌escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）基因PCR檢測(cè)靈敏度結(jié)果Fig.3 PCR sensitivity of escV (A), stx2 (B), and hlyA (C) in E.coli

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

重組質(zhì)粒PCR結(jié)果顯示各個(gè)毒力基因的片段大小相一致，表明轉(zhuǎn)入的重組質(zhì)粒中含有目的基因。將escV、stx2、hlyA重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與GeneBank上已經(jīng)公布的序列進(jìn)行比對(duì)，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)率都為100%、100%、100%，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。將經(jīng)篩選連接轉(zhuǎn)化成功后的重組子繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)15 代，并進(jìn)行質(zhì)粒提取，每隔代送檢測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與上述測(cè)序結(jié)果相同，說(shuō)明在傳代過(guò)程中沒有發(fā)生堿基丟失、錯(cuò)配、突變的現(xiàn)象。

圖4 大腸桿菌escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）測(cè)序比對(duì)結(jié)果Fig.4 Sequence alignment results of escV (A), stx2 (B), and hlyA (C) in E.coli

2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備及分析結(jié)果

用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒提取，所提質(zhì)粒用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量濃度和純度如表3所示，A260nm/A280nm均在1.8～2.0之間，純度良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，GeneBank上已經(jīng)公布的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)率均為100%。

表3 重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度和純度Table 3 Concentration and purity of recombinant plasmids

2.3.1 均勻性結(jié)果

隨機(jī)挑選escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品15 管進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果如表4所示，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度F值均小于F0.05（14，30）=2.04，15 管之間不存在顯著性差異，樣品均勻性較好。

表4 escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度Table 4 Homogeneity evaluation: concentrations of escV, stx2 and hlyA plasmid standards ng/μL

2.3.2 短期穩(wěn)定性結(jié)果

在25、4、-20 ℃ 3 個(gè)溫度下貯存14 d，各個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度相近，沒有顯著性變化（表5），數(shù)據(jù)之間離散程度較小，PCR擴(kuò)增均可擴(kuò)增出單一明亮的特異性條帶（圖5），說(shuō)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品短期穩(wěn)定性好。

表5 escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品短期質(zhì)量濃度Table 5Short-term stability evaluation: concentrations of escV, stx2 and hlyA plasmid standards ng/μL

圖5 escV（A）、stx2（B）和hlyA（C）質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品定性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Qualitative test results with escV (A), stx2 (B) and hlyA (C)plasmid standards

2.3.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果

在25、4、-20 ℃ 3 個(gè)溫度下貯存5 個(gè)月，各個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度沒有顯著性變化（表6），數(shù)據(jù)之間離散程度較小，PCR擴(kuò)增均可擴(kuò)增出單一明亮的特異性條帶，說(shuō)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)期穩(wěn)定性好。

表6 escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)期質(zhì)量濃度測(cè)定Table 6Long-term stability evaluation: concentrations of escV, stx2 and hlyA plasmid standardsng/μL

2.3.4 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖6所示，通過(guò)計(jì)算得到escV、stx2和hlyA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限分別為3.93×106、2.41×105拷貝/μL和2.14×105拷貝/μL。

圖6 梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品escV（A）、stx2（B）、hlyA（C）的1.5%電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis of gradient dilutions of plasmid standards escV (A), stx2 (B), and hlyA (C)

2.3.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在枸杞子中的應(yīng)用

將34 批枸杞子樣品進(jìn)行escV、stx2、hlyA檢測(cè)，在34 批枸杞子樣品中，沒有檢測(cè)出escV、stx2，16號(hào)、33號(hào)和34號(hào)枸杞子樣品中檢測(cè)出hlyA（圖7）。

圖7 枸杞子樣品中hlyA的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 PCR results of hlyA in L.barbarum samples

選擇PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的3 批枸杞樣品按照GB 4789.6—2016《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果沒有檢測(cè)出大腸桿菌。

3 討 論

食品原料在加工、包裝、運(yùn)輸和貯存過(guò)程中，由于溫度、濕度、空氣和光線等條件沒有嚴(yán)格控制會(huì)使質(zhì)量下降，產(chǎn)生安全隱患[25-26]，霉變、蟲蛀是最常見的變異現(xiàn)象，對(duì)于糖分、脂肪含量高的食品原料更容易發(fā)生腐爛變質(zhì)、產(chǎn)生菌絲、微生物污染等現(xiàn)象[27-28]。本研究所用的枸杞子是2018年1月在不同產(chǎn)地收集，自然條件下貯存，并用構(gòu)建的escV、stx2、hlyA質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了大腸桿菌致病菌檢測(cè)，結(jié)果在34 批樣品中escV、stx2沒有被檢測(cè)出，有3 批枸杞樣品中檢測(cè)出hlyA，檢出率為8.82%，選擇被檢出的3 批枸杞子樣品，進(jìn)行傳統(tǒng)的微生物分離方法進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，結(jié)果沒有檢測(cè)出大腸桿菌。沒有檢出并不能代表枸杞子中不含有大腸桿菌，傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法中使用的增菌液沒有針對(duì)性的對(duì)目的菌增菌，在大的微生物污染環(huán)境下，目標(biāo)致病菌就很可能被抑制生長(zhǎng)，大大降低了檢出率[29]。PCR檢測(cè)方法和傳統(tǒng)的微生物分離檢測(cè)技術(shù)相比不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性也更高[30-31]，本研究采用常規(guī)的PCR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合質(zhì)粒構(gòu)建成功構(gòu)建了用于快速檢測(cè)大腸桿菌的重組質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，相對(duì)于傳統(tǒng)微生物分離鑒定檢出率有了很大的提高。姜睿嬌等[32]通過(guò)雙重?zé)晒舛縋CR方法和質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)結(jié)合成功構(gòu)建了用于快速檢測(cè)副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并對(duì)臨床28 份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性檢出率為53.57%，同時(shí)也采用了常規(guī)PCR技術(shù)和細(xì)菌分離鑒定同步進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出率分別為46.42%和28.57%。隨著對(duì)微生物快速檢測(cè)的要求越來(lái)越高，傳統(tǒng)的細(xì)菌分離檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)不能滿足需求，細(xì)菌分離也較為困難，能分離出的細(xì)菌種類較少[33]，并且耗時(shí)較長(zhǎng)，大大降低了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率。將PCR技術(shù)與多種技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用到食品中微生物的快速檢測(cè)，不僅克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的弊端，得到的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度和靈敏度更高，檢測(cè)效率也有了很大的提高。

本研究中構(gòu)建的大腸桿菌中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過(guò)菌落PCR、測(cè)序以及傳代進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果呈現(xiàn)100%，測(cè)序與GeneBank上已經(jīng)公布的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)率也均為100%，傳代結(jié)果也顯示出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的穩(wěn)定性。本研究使用的是一種即用型的陽(yáng)性選擇克隆載體pLB-simple Vector，pLB是在pLL3.7載體基礎(chǔ)上的修改，添加了已知的防止表觀遺傳沉默的遺傳元件，由于該載體含有一種致死基因，因此當(dāng)克隆位點(diǎn)處插入外源片段時(shí)就會(huì)引起基因的失活[34]，只有轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的細(xì)菌才能存活形成克隆菌落，可以保證在連接的過(guò)程中重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建，基于pLB載體的這個(gè)優(yōu)勢(shì)，它在載體構(gòu)建中得到了廣泛的應(yīng)用，本研究中制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，純度也較好。本研究將制備成功的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了無(wú)菌凍干處理，制備成質(zhì)量濃度在400 ng/μL左右的凍干粉，并進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉均勻性、穩(wěn)定性都較好，由于將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了無(wú)菌凍干，也減少了凍干粉貯存過(guò)程中的污染機(jī)率，有研究將大腸桿菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液進(jìn)行了無(wú)菌凍干處理，并對(duì)其進(jìn)行了均勻性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其均勻性結(jié)果無(wú)顯著性差異，保存過(guò)程中穩(wěn)定性也較好[35-36]。

大腸桿菌作為食品安全微生物限量指標(biāo)中的指示菌[37]，不同的食品中對(duì)大腸桿菌的檢出限量有不同的規(guī)定，當(dāng)環(huán)境中檢出含有大腸桿菌時(shí)，說(shuō)明可能存在大腸桿菌污染，大腸桿菌本身作為一種正常腸道菌群，在一定的環(huán)境下可以使人致病[38]。當(dāng)人們的日常飲食被大腸桿菌污染時(shí)，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)，不僅可以起到預(yù)防作用，減少疾病的爆發(fā)，也能做到溯源，有效地控制污染源的散播。

4 結(jié) 論

目前，我國(guó)對(duì)于食品安全未知風(fēng)險(xiǎn)發(fā)現(xiàn)能力較弱、風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別與評(píng)估技術(shù)周期長(zhǎng)、效率低、食品安全檢測(cè)技術(shù)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)缺乏[39-40]。無(wú)論與食品安全形勢(shì)的實(shí)際需求，還是與國(guó)際食品安全基本標(biāo)準(zhǔn)相比，都存在較大差距。尤其是食品微生物定性和定量檢驗(yàn)DNA參考物質(zhì)體系不完整，極大限制了檢驗(yàn)檢測(cè)的水平。本研究以食源性微生物大腸桿菌為研究對(duì)象，構(gòu)建大腸桿菌中常見毒力基因的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，并對(duì)常用藥食兩用資源枸杞子進(jìn)行檢測(cè)，建立了一種可以應(yīng)用的技術(shù)和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品能夠?yàn)镻CR快速檢測(cè)食品和中藥中大腸桿菌提供陽(yáng)性對(duì)照，減小了方法的不確定性，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的可溯源性，為食品中大腸桿菌的快速檢測(cè)提供技術(shù)參考。