張 敏，吳俊銓，姚嘉文，楊春婷，白衛(wèi)東,2，趙曉娟,2,

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225）

尸胺又名1,5-二氨基戊烷、尸毒素，屬于脂肪族多胺類化合物，是由賴氨酸在賴氨基酸脫羧酶的作用下進(jìn)行脫羧反應(yīng)形成的一種多胺類化合物，廣泛存在于生物體中[1-2]。有研究表明，尸胺具有刺激生長(zhǎng)、延緩衰老的作用[3-4]。但尸胺具有腐蝕性和毒性，人們經(jīng)過食物食入過量尸胺，會(huì)引起機(jī)體的炎癥、痙攣、水腫，甚至導(dǎo)致死亡[5-6]。食物中的尸胺可以與亞硝酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生致癌物質(zhì)——亞硝基胺，尸胺也會(huì)使食物中組胺的毒性增大[7-8]。鑒于尸胺的生理和毒理學(xué)影響，其在食品中的存在已成為一個(gè)潛在的公共衛(wèi)生問題。尸胺一般被認(rèn)為是肉類中微生物衰變程度的關(guān)鍵性化合物。由于肉類腐敗變質(zhì)后通常含有高濃度的尸胺，因此，可用來作為食品新鮮度的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)[9-10]。尸胺的檢測(cè)對(duì)保障人們的健康和提高食品的品質(zhì)安全有著重要的意義。

目前，檢測(cè)食品中尸胺的方法主要有薄層色譜法[11-13]、離子色譜法[14]、液相色譜法[15-18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19]、毛細(xì)管電泳法[20-21]和生物傳感器法[22]等。其中，生物傳感器法靈敏度高、檢測(cè)速度快，在生物胺的檢測(cè)食品品質(zhì)與安全領(lǐng)域備受研究關(guān)注，有廣泛的應(yīng)用前景。血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是鐵蛋白的一種，由4 個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基由一條肽鏈和一個(gè)血紅素分子構(gòu)成，結(jié)構(gòu)清晰，分布廣泛，是研究生物傳感器的理想模型。研究表明，Hb被尿素和酸共同誘導(dǎo)變性后，其對(duì)過氧化氫的催化能力可增強(qiáng)15 倍左右[23]。因此，利用變性血紅蛋白（unfolded hemoglobin，uHb）制備傳感器可顯著提高檢測(cè)靈敏度。二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）也被稱作含吡哆醛的胺氧化酶，尸胺等二胺可以在DAO的催化作用下脫去氨基生成氨、醛及過氧化氫，通過測(cè)定過氧化氫的生成量可以確定待測(cè)樣品中生物胺的含量。唐晗等[24]用DAO作為生物傳感器的分子識(shí)別元件，以魯米諾-鐵氰化鉀作為化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，建立了一種快速高效的食品中生物胺含量的檢測(cè)方法。Shanmugam等[25]將DAO與納米四氧化三鐵通過共價(jià)結(jié)合固定于玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）表面，制備了一種檢測(cè)腐胺的生物傳感器。納米金（AuNPs）具有良好的生物相容性，易于進(jìn)行表面修飾，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性[26]。由于AuNPs還具有高比表面積、高活性、特殊的物理性質(zhì)等特點(diǎn)，在傳感器領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[27-28]。朱旭等[29]利用多電位脈沖沉積法制備AuNPs修飾電極（AuNPs/GCE），再將L-精氨酸電聚合在AuNPs/GCE表面，制備出的聚L-精氨酸/AuNPs/GCE測(cè)定多巴胺時(shí)響應(yīng)靈敏、特異性高。本研究基于DAO催化尸胺產(chǎn)生H2O2和uHb對(duì)H2O2具有良好催化能力的原理，結(jié)合Clay-AuNPs構(gòu)建了一種高靈敏的電化學(xué)生物傳感器，并用于馬鮫魚中尸胺含量的檢測(cè)，為馬鮫魚等各種樣品中尸胺含量的快速測(cè)定及新鮮度評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鮫魚 廣州黃沙水產(chǎn)交易市場(chǎng)；尸胺二鹽酸鹽（98%）、苯乙胺（≥99.0%）、精胺（≥99.0%）、腐胺二鹽酸鹽（≥99.0%）、酪胺鹽酸鹽（≥98%）、亞精胺磷酸鹽六水合物（≥99.0%）、組胺二磷酸鹽（≥99.0%）、色胺（98%）、二胺氧化酶（≥0.05 U/mg）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；檸檬酸鈉（98.5%）、氫氧化鈉（96%）、磷酸氫二鈉（≥99.0%） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；氯金酸（Au≥49%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸（70%～72%）、氯化血紅素（97%）、戊二醛（glutaraldehyde，GLU）（50%）上海麥克林生化科技有限公司；過氧化物酶（BR，≥250 U/mg）、牛血紅蛋白（BR，≥15%（以N計(jì)））、尿素（≥99.0%） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E電化學(xué)分析儀 北京華科普天科技有限公司；三電極系統(tǒng)：工作電極為GCE（Φ=3 mm）或修飾的GCE，參比電極為Ag/AgCl電極（飽和KCl溶液），輔助電極為鉑絲電極 上海辰華儀器有限公司；BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HR/T20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；旋渦混勻器 上海安戈儀器有限公司；便攜式pH計(jì) 奧豪斯儀器（上海）有限公司；JEM-2100F透射電鏡（200 kV加速電壓） 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 電極預(yù)處理方法

將GCE依次用粒徑為1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉在專用拋光絨毛墊上拋光，用超純水淋洗干凈后，再分別置于硝酸（1＋1）、無水乙醇、超純水中各超聲1 min，淋洗干凈，然后將其置于0.5 mol/L硫酸溶液中，在-1.0～1.0 V電位區(qū)間內(nèi)，以50 mV/s的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安（cyclic voltammograms，CV）掃描，直到獲得穩(wěn)定的CV響應(yīng)曲線。最后，將預(yù)處理的GCE室溫下晾干備用。

1.3.2 電極修飾材料的制備

1.3.2.1 1 mg/mL黏土（Clay）分散液

準(zhǔn)確稱取Clay于超純水中，超聲分散均勻后置于4 ℃冰箱過夜膨脹，備用。

1.3.2.2 納米金（AuNPs）

AuNPs的制備參考文獻(xiàn)[30-31]方法。首先將實(shí)驗(yàn)過程中所要用到的玻璃器皿，用HNO3-HCl（1∶3，V/V）清洗干凈，然后吸取1 mL氯金酸溶液（0.01%）于燒杯中，并加入99 mL的水，用恒溫磁力加熱攪拌器加熱到沸騰，再逐滴加6 mL 1%的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱待反應(yīng)液變?yōu)榫萍t色，停止加熱，繼續(xù)攪拌15 min后自然冷卻至室溫，用純水定容至100 mL容量瓶刻度線后，放于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2.3 黏土-納米金（Clay-AuNPs）復(fù)合材料

將Clay分散液和AuNPs按照2∶1體積比進(jìn)行混合，并用渦旋混勻器混勻，放于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2.4 uHb溶液（酸性條件下尿素誘導(dǎo)）

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的尿素，溶于0.1 mol/L PBS（pH 2.0）溶液，配制成3 mol/L的尿素溶液。接著稱取一定量的牛血紅蛋白溶于3 mol/L尿素溶液（pH 2.0），配制63 μmol/L的變性Hb溶液。將配制好的變性Hb溶液在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存23 h以達(dá)到變性平衡。

1.3.2.5 DAO溶液

準(zhǔn)確稱取DAO溶于0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，配制成不同濃度的DAO溶液。

1.3.2.6 GLU溶液

準(zhǔn)確量取一定體積的50% GLU溶液，以超純水稀釋成2.5%的GLU溶液。

1.3.3 修飾電極的制備

取5 μL的Clay-AuNPs分散液均勻滴涂于GCE表面，室溫晾干后制得Clay-AuNPs修飾的GCE（Clay-AuNPs/GCE）。將Clay-AuNPs/GCE置于變性Hb溶液中，于4 ℃冰箱靜置吸附1 h，使uHb固定在電極表面，吸附完成后以超純水淋洗電極，室溫晾干后得到uHb/Clay-AuNPs/GCE。將2 μL的GLU溶液均勻滴涂于uHb/Clay-AuNPs/GCE上，然后立即在其表面再滴涂5 μL的DAO溶液，室溫晾干后得到DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE。電極不用時(shí)置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 樣品處理

馬鮫魚樣品的處理參考文獻(xiàn)[32]方法。稱取2.0 g已粉碎的馬鮫魚樣品，置于50 mL的離心管中，加入8 mL 0.4 mol/L的高氯酸溶液，用渦旋振蕩器振蕩1 min；于10 000 r/min離心10 min，且需重復(fù)進(jìn)行一次，并將兩次提取的上清液合并移至25 mL容量瓶中，用濃度為0.4 mol/L高氯酸溶液定容。移取10.00 mL魚樣提取液于離心管中，加入10.00 mL正己院，渦旋振蕩5 min，棄去上層有機(jī)相，需重復(fù)進(jìn)行一次，合并兩次去脂后的樣液，即為待測(cè)樣液。

1.3.5 伏安測(cè)試

將工作電極、參比電極和輔助電極置于不同濃度的尸胺標(biāo)準(zhǔn)液中，于電位-0.7～0.3 V，電位增量4 mV/s，方波振幅25 mV，方波頻率15 Hz條件下進(jìn)行方波伏安（square wave voltammetry，SWV）掃描。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制方法

利用Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。選用Origin 8.1作為繪圖軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs的透射電鏡分析

將制備好的AuNPs進(jìn)行透射電鏡表征，并對(duì)100 個(gè)AuNPs顆粒的粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖1所示。可以觀察到分散良好和幾乎為球形的納米粒子，且納米粒子的粒徑分布相對(duì)較窄，大部分粒徑在3.5～6.5 nm范圍內(nèi)，平均粒徑約為5.0 nm。

圖1 AuNPs的透射電鏡圖（A）和粒徑分布圖（B）Fig.1 Transmission electron micrograph (A) and particle size distribution of AuNPs (B)

2.2 測(cè)試底液pH值的選擇

配制底液的pH值會(huì)影響尸胺在溶液中的存在狀態(tài)以及穩(wěn)定性，從而影響尸胺與DAO的作用能力。利用SWV考察DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在不同濃度pH 7.0的尸胺溶液和pH 10.0的尸胺溶液中的電流響應(yīng)（圖2）。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在pH 10.0的底液中的響應(yīng)電流值隨著尸胺濃度的增加而增加，這主要是由于在pH 10.0的底液中尸胺帶負(fù)電荷，有利于其與帶正電荷的DAO發(fā)生反應(yīng)，高濃度的尸胺可產(chǎn)生較多的H2O2，從而使響應(yīng)電流增大。所以，選擇尸胺測(cè)試底液的最佳pH值為10.0。

圖2 pH 7.0（A）和pH 10.0（B）PBS配制的尸胺溶液在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE上的SWV圖Fig.2 SWV curves for cadaverine in pH 7.0 (A) and pH 10.0 (B) PBS on DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE

2.3 電極修飾條件的優(yōu)化

2.3.1 修飾體系的選擇

圖3 不同修飾電極對(duì)尸胺的電化學(xué)響應(yīng)情況Fig.3 Electrochemical responses of different modified electrodes to cadaverine

分別制備Hb/Clay-AuNPs/GCE、uHb/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/Hb/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，考察不同修飾電極在濃度為6×10-12mol/L和1×10-7mol/L的尸胺溶液中的電化學(xué)響應(yīng)情況，分別計(jì)算各修飾電極在上述兩個(gè)濃度的尸胺溶液中的響應(yīng)電流差值（ΔI），并以ΔI衡量電極的測(cè)試效果，結(jié)果如圖3所示。尸胺溶液在DAO-GLU/Clay-AuNPs/GCE上未出現(xiàn)電化學(xué)響應(yīng)。Hb/Clay-AuNPs/GCE和DAO-GLU/Hb/Clay-AuNPs/GCE的測(cè)試效果較差。uHb/Clay-AuNPs/GCE和DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的ΔI大，說明這兩種修飾電極在尸胺溶液中的測(cè)試效果較好。由于DAO對(duì)尸胺等生物胺的催化具有較強(qiáng)的專一性，可以避免電極在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)受到其他物質(zhì)的干擾，從而提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，選擇DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE對(duì)尸胺進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2 過氧化物酶（模擬酶）的選擇

辣根過氧化物酶、氯化血紅素以及變性Hb均可以催化由DAO和尸胺反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2，從而產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)。在相同條件下，分別制備3 種過氧化物酶（模擬酶）修飾電極：DAO-GLU/Hm/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/HRP/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，考察這3 種修飾電極在濃度為6.0×10-12mol/L和1.0×10-7mol/L的尸胺溶液中電流響應(yīng)情況。如圖4所示，尸胺在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE表面的響應(yīng)電流值隨著尸胺濃度的增加而增加，還原峰形明顯，說明由uHb修飾的電極催化活性較高，更適合用于尸胺的測(cè)定。因此，選擇變性Hb作為過氧化物酶（模擬酶）對(duì)電極進(jìn)行修飾。

圖4 pH 10.0尸胺溶液在DAO-GLU/Hm/Clay-AuNPs/GCE（A）、DAO-GLU/HRP/Clay-AuNPs/GCE（B）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（C）上的SWV圖Fig.4 SWV curves for cadaverine in pH 10.0 PBS on DAO-GLU/Hm/Clay-AuNPs/GCE (A), DAO-GLU/HRP/Clay-AuNPs/GCE (B) and DAOGLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (C)

2.3.3 DAO修飾條件的優(yōu)化

2.3.3.1 DAO配制底液的選擇

酶配制底液的pH值及其所含的電解質(zhì)類型對(duì)酶的存在狀態(tài)和催化活性有一定影響，常見的酶配制底液為中性的磷酸鹽緩沖液，但也可用其他溶液進(jìn)行配制[33]。為選擇最佳的DAO配制底液，分別以0.05 mol/L的硼酸溶液（pH 8.3）和0.1 mol/L的PBS（pH 7.0）配制相同濃度的DAO溶液（分別表示為(-)DAO和DAO），將其通過GLU交聯(lián)固定于uHb/Clay-AuNPs/GCE表面，制得兩種酶修飾電極，通過考察這兩種修飾電極在濃度為6.0×10-12mol/L和1.0×10-7mol/L的尸胺溶液中的SWV響應(yīng)情況，選出適合配制DAO的底液。如圖5所示，由pH 7.0 PBS配制的DAO溶液修飾得到的電極對(duì)尸胺的響應(yīng)較靈敏，說明用pH 7.0 PBS配制的DAO對(duì)測(cè)試溶液中的尸胺有較高的催化活性，因此選用0.1 mol/L PBS（pH 7.0）作為DAO的配制底液。

圖5 pH 10.0尸胺溶液在(－)DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（A）和DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（B）上的SWV圖Fig.5 SWV curves for cadaverine in pH 10.0 PBS on (-)DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (A) and DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (B)

2.3.3.2 DAO濃度的優(yōu)化

DAO修飾濃度的高低對(duì)DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的性能有一定影響，質(zhì)量濃度過低會(huì)使修飾在電極表面同等面積的DAO膜中酶活單位減少，不能完全催化尸胺產(chǎn)生H2O2。DAO濃度越高，修飾膜越厚，不利于電子傳遞。分別以0.1 mol/L PBS（pH 7.0）配制10、30、50、60、70、80 mg/mL和90 mg/mL的DAO溶液，進(jìn)一步修飾得到不同的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，分別置于濃度為6.0×10-12mol/L和1.0×10-11mol/L的尸胺溶液中，測(cè)定不同濃度酶修飾電極的SWV響應(yīng)電流值，最后以上述兩個(gè)濃度尸胺溶液的響應(yīng)電流差值，判斷各電極的靈敏度大小。如圖6所示，隨著DAO質(zhì)量濃度的增加，電極的響應(yīng)電流差不斷增加，并在70 mg/mL時(shí)電流差達(dá)最大值，說明當(dāng)DAO質(zhì)量濃度為70 mg/mL時(shí)，DAO膜的厚度適宜，酶的催化活性最高，從而使DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE具有較高的測(cè)試靈敏度。因此選擇70 mg/mL DAO溶液進(jìn)行修飾。

圖6 不同質(zhì)量濃度DAO修飾電極在6.0×10－12 mol/L和1.0×10－11 mol/L尸胺溶液中的電流差比較圖Fig.6 Comparison of current difference for electrodes modified by DAO at different concentrations in 6.0 × 10-12 mol/L and 1.0 × 10-11 mol/L cadaverine solutions

2.4 DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的電化學(xué)表征

2.4.1 CV法

將GCE、Clay-AuNPs/GCE、uHb/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE置于5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中，利用CV法進(jìn)行表征，結(jié)果如圖7所示。由于Clay表面的負(fù)電荷對(duì)[Fe(CN)6]3-具有一定的排斥作用，K3Fe(CN)6在Clay-AuNPs/GCE（線b）上的氧化還原峰電流比在GCE（線a）上的明顯減小。將uHb修飾在Clay-AuNPs/GCE上，由于uHb大的空間位阻使K3Fe(CN)6的響應(yīng)電流進(jìn)一步降低（線c）。K3Fe(CN)6在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE上的氧化還原峰幾乎消失，主要是由于DAO大的空間位阻阻礙了電子傳遞，同時(shí)表明DAO已固定在電極表面。

圖7 GCE（a）、Clay-AuNPs/GCE（b）、uHb/Clay-AuNPs/GCE（c）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（d）在5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中的CV圖Fig.7 Cyclic voltammograms for 5 mmol/L K3Fe(CN)6 on GCE (a),Clay-AuNPs/GCE (b), uHb/Clay-AuNPs/GCE (c), and DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (d)

2.4.2 EIS分析

利用電化學(xué)阻抗（electrochemical impedance，EIS）對(duì)DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的制備及應(yīng)用過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，研究修飾電極的界面性質(zhì)，得到EIS的Nyquist圖譜（圖8）。高頻區(qū)半圓的直徑代表電子轉(zhuǎn)移阻抗（Rct），其大小反映K3Fe(CN)6等氧化還原探針在電極表面的電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)特性。由圖8可以看出，與GCE（線a）相比，Clay-AuNPs/GCE（線b）的Rct明顯增加，主要是由于Clay表面的負(fù)電荷對(duì)[Fe(CN)6]3-具有一定的排斥作用。uHb/Clay-AuNPs/GCE（線c）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GC（線d）和測(cè)試過尸胺溶液的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（線e）的Rct進(jìn)一步依次增大，這主要是由于uHb和DAO大的空間位阻妨礙了電子轉(zhuǎn)移，同時(shí)也表明uHb和DAO已被成功固定在電極表面。

圖8 GCE（a）、Clay-AuNPs/GCE（b）、uHb/Clay-AuNPs/GCE（c）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（d）、測(cè)試過尸胺的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（e）在5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中的EIS譜Fig.8 Nyquist plots of EIS for 5 mmol/L K3Fe(CN)6 on GCE (a), Clay-AuNPs/GCE (b), uHb/Clay-AuNPs/GCE (c), DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (d), and DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (e) used for testing cadaverine

2.5 性能測(cè)試

2.5.1 重復(fù)性

2.5.1.1 測(cè)試重復(fù)性

用同一支DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在6.0×10-12mol/L尸胺溶液中連續(xù)掃描10 次，記錄每次測(cè)定的尸胺還原峰電流值，并計(jì)算得出電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為4.2%（n=10），表明DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE有較好的測(cè)試重復(fù)性。

2.5.1.2 制作重復(fù)性

制作5 支DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，在優(yōu)化條件下對(duì)6.0×10-12mol/L尸胺溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得峰電流值的RSD為5.5%（n=5），表明DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE有較好的制作重復(fù)性。

2.5.2 選擇性

以6.0×10-12mol/L尸胺溶液為對(duì)照，采用SWV法考察相同濃度的其他7 種生物胺，包括苯乙胺、精胺、酪胺、色胺、腐胺、亞精胺和組胺在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE上的電化學(xué)響應(yīng)情況。如圖9所示，尸胺在該修飾電極上的響應(yīng)靈敏度最高，在所測(cè)試的其他7 種生物胺中，苯乙胺的電化學(xué)響應(yīng)極小，其余6 種生物胺均產(chǎn)生了一定的響應(yīng)。以尸胺的響應(yīng)值（按100%計(jì)）為參比，其他7 種生物胺的相對(duì)響應(yīng)值大小順序依次為：組胺（28.7%）、亞精胺（26%）、腐胺（25.2%）、色胺（22%）、精胺（16.4%）、酪胺（11.7%）、苯乙胺（2%）。因?yàn)轳R鮫魚變質(zhì)后會(huì)產(chǎn)生大量的尸胺，所以可以利用DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE對(duì)馬鮫魚中的生物胺含量（以尸胺計(jì)）進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步可對(duì)馬鮫魚的新鮮度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖9 相同濃度的其他7 種生物胺與尸胺的響應(yīng)值比較圖Fig.9 Comparison of electrochemical responses for other seven bioamines and cadaverine at the same concentration

2.5.3 穩(wěn)定性

制備4支DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，于第1天測(cè)定6.0×10-12mol/L尸胺溶液并記錄其響應(yīng)電流值，然后放于4 ℃冰箱保存。第7天時(shí)DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE對(duì)尸胺的響應(yīng)電流值可以達(dá)到初始電流的95.2%，說明該電極在1 周內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 線性范圍和檢出限

圖10 DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在不同濃度尸胺溶液中的SWV圖Fig.10 SWV curves for cadaverine at different concentrations on DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，用DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE測(cè)定不同濃度的尸胺溶液，結(jié)果如圖10所示。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在尸胺溶液中產(chǎn)生的還原峰電流值隨尸胺濃度的增加而增大，還原峰電流差值（ΔI=I尸胺-IPBS）與尸胺濃度C在2.0×10-12～1.0×10-11mol/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：ΔI=37.181 2C＋2.402 8（r=0.991）。該法測(cè)定尸胺的檢出限（RSN=3）為6.7×10-13mol/L。

2.6 樣品分析與回收率的測(cè)定

取購買的冷鮮馬鮫魚，按照1.3.4節(jié)的樣品前處理法進(jìn)行前處理，然后使用SWV法進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)得該馬鮫魚樣品液中尸胺濃度為7.22×10-12mol/L，經(jīng)換算得出該馬鮫魚樣品中尸胺含量為23.05 mg/kg。為了驗(yàn)證此方法的準(zhǔn)確性，對(duì)馬鮫魚樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。馬鮫魚樣品中3.0×10-12mol/L尸胺的加標(biāo)回收率為82.2%～109.1%，RSD為5.7%。

2.7 貯藏期間馬鮫魚中尸胺的變化

采用DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時(shí)對(duì)剛采購新鮮馬鮫魚（第0天）進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，即將新鮮馬鮫魚置于4 ℃冰箱內(nèi)貯存，每隔1 d測(cè)定1 次，分別監(jiān)測(cè)第0、2、4、6天馬鮫魚中尸胺含量的變化，結(jié)果如表1所示。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的測(cè)定結(jié)果與HPLC較為接近，表明該生物傳感器法具有較高的準(zhǔn)確度。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鮫魚中尸胺的含量也逐步增加，在貯藏至4 d后尸胺含量顯著上升，此時(shí)馬鮫魚已失去光澤，腥臭味較重，紋理模糊，出現(xiàn)腐敗狀態(tài)，表明尸胺含量與馬鮫魚的腐敗變質(zhì)密切相關(guān)，因此可根據(jù)其含量變化對(duì)馬鮫魚貯藏期間的新鮮度進(jìn)行快速評(píng)價(jià)。

表1 4 ℃貯藏的馬鮫魚尸胺含量變化（n=4）Table 1 Changes in cadaverine content of mackerel stored at 4 ℃ (n= 4)

圖11 DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE與HPLC法檢測(cè)樣品中尸胺的線性相關(guān)性分析Fig.11 Linear correlation analysis between measured values of cadaverine in samples by DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE and HPLC

對(duì)2 種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，以DAOGLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE測(cè)得的尸胺含量為x軸，以HPLC法測(cè)得的尸胺含量為y軸，繪制散點(diǎn)圖，做擬合曲線，結(jié)果如圖11所示。線性回歸方程為y=0.980 2x-6.389 2，r=0.999，說明基于DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的電化學(xué)生物傳感器法檢測(cè)馬鮫魚樣品中的尸胺結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)基于二胺氧化酶可催化尸胺產(chǎn)生H2O2和變性Hb對(duì)H2O2具有良好的催化能力，建立了一種測(cè)定尸胺含量的電化學(xué)生物傳感器法。為了得到最優(yōu)的檢測(cè)效果，對(duì)DAO的修飾質(zhì)量濃度、過氧化物酶（模擬酶）的選擇以及測(cè)試條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用EIS和CV對(duì)修飾電極進(jìn)行表征。結(jié)果表明：通過物理吸附法將酸和尿素誘導(dǎo)變性的血紅蛋白固定在Clay-AuNPs/GCE表面，然后以2.5%的GLU為交聯(lián)劑固定二胺氧化酶制得的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE對(duì)尸胺有較好的檢測(cè)效果，檢出限為7.6×10-13mol/L。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，且靈敏度高，可用于馬鮫魚等樣品中尸胺含量的測(cè)定。