麻曉霞，蔡 彥，馬玉龍

（寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川 750021）

隨著石油資源的減少和環(huán)境污染問題的增加，世界各國正在迫切尋求一種新型的可再生能源。生物質(zhì)能源具有原料來源豐富、再生性強(qiáng)、低污染和使用范圍廣等優(yōu)勢，其高效轉(zhuǎn)化與應(yīng)用研究引起科學(xué)工作者的關(guān)注[1，2]。玉米秸稈是一種常見生物質(zhì)資源，其主要成分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等[3]，可轉(zhuǎn)化成常規(guī)的固、液和氣態(tài)燃料[4]。由于木質(zhì)素致密的三維網(wǎng)狀芳環(huán)結(jié)構(gòu)和纖維素高結(jié)晶度的特點(diǎn)，使其阻礙了酶或微生物降解過程的可及性[5]，這也是秸稈不能直接被微生物利用轉(zhuǎn)化為液體燃料和其他化工、醫(yī)藥中間體的主要原因。因此，對秸稈內(nèi)部結(jié)構(gòu)實(shí)施解聚處理，破壞纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的聯(lián)結(jié)，使結(jié)構(gòu)有效組分得以暴露或解離，是提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用率，實(shí)現(xiàn)秸稈生物質(zhì)能源的先決條件[6]。

原料預(yù)處理方法的選擇直接關(guān)系到后續(xù)酶解和發(fā)酵效率的高低。目前研究報(bào)道的預(yù)處理方法主要有物理法、化學(xué)法[7，8]、生物法[9]或幾種方法的耦合[10，11]，雖有一定的效果，但還不能達(dá)到預(yù)期要求[12]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，堿處理法不僅可有效降低纖維素的聚合度和結(jié)晶度，還能增強(qiáng)纖維素糖苷鍵間的識(shí)別與結(jié)合，并增加酶分子間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量，從而有效提高半纖維素的產(chǎn)率和酶解糖化率[13]。另外，高溫蒸汽爆破也可使木質(zhì)素和半纖維素結(jié)合層被破壞，造成纖維素晶體和纖維束的爆裂，更易被降解利用。因此，本文以玉米秸稈纖維素為主要研究對象，探討利用堿/高溫蒸汽進(jìn)行預(yù)處理的效果，考察NaOH 濃度、固液比、加熱時(shí)間等因素對預(yù)處理效果的影響，為玉米秸稈的資源化利用提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料與儀器

玉米秸稈由寧夏賀蘭農(nóng)場提供。用蒸餾水去除表面雜質(zhì)，風(fēng)干后粉碎，過篩，105 ℃下烘干備用。纖維素酶的活性為200 000 FIU/g，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 單預(yù)處理試驗(yàn)

稱取一定量的玉米秸稈置于燒杯中，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH 溶液（1 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %），在不同的固液比（1:5、1:8、1:10、1:20、1:30）下，進(jìn)行蒸汽（20 ℃，0.14 MPa）加熱，加熱時(shí)間為2 min、5 min、10 min、20 min、30 min，將處理完的秸稈洗滌，調(diào)至中性，過濾，105 ℃烘干備用。

2.2 預(yù)處理后玉米秸稈纖維素酶解試驗(yàn)

在250 mL 具塞三角瓶中，分別加入2.0 g 上述預(yù)處理的玉米纖維素和100 U 單位的纖維素酶，用100 mL、0.2 mol/L 的HAc-NaAc 緩沖液（pH=4.8）浸泡后，置于轉(zhuǎn)速為100 r/min 的恒溫振蕩器中，在50 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 時(shí)取樣，用于測定還原糖得率。

2.3 檢測指標(biāo)及分析方法

玉米秸稈中酸性洗滌木質(zhì)素、中性洗滌纖維素和酸性洗滌纖維素測定分別參照GB/T 20805-2006，GB/T 20806-2006，NY/T 1459-2007 中的方法。還原糖含量測定采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）比色法[14]。

此外，秸稈改性前后秸稈表面結(jié)構(gòu)的改變采用掃描電鏡（SEM）進(jìn)行表征。

3 結(jié)果與討論

3.1 NaOH溶液濃度對酶解效果的影響

在加熱時(shí)間為30 min，固液比為1:10 的條件下，考察NaOH 溶液濃度對酶解效果的影響（見圖1）。由圖1 可以看出，未經(jīng)過預(yù)處理對原樣進(jìn)行酶解后的葡萄糖得率明顯較低。堿能促進(jìn)木質(zhì)素溶解，從而破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高酶解糖化率。另外，堿處理能破壞纖維素中的部分氫鍵，使部分酯鍵發(fā)生皂化反應(yīng)，使纖維素的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[15]。經(jīng)過堿/高溫蒸汽預(yù)處理后，隨著酶解時(shí)間的延長，還原糖含量越來越大；當(dāng)NaOH濃度增加（≤4 %），相同酶解時(shí)間下，還原糖量有所增加，玉米秸稈的還原糖產(chǎn)量在NaOH 濃度為4 %時(shí)達(dá)到最大，酶解72 h 還原糖得率為48 %。繼續(xù)增加NaOH 濃度，還原糖得率呈下降趨勢?？梢?，NaOH 濃度為4 %時(shí)，可最大程度地溶解木質(zhì)素和半纖維素，促進(jìn)纖維素酶發(fā)揮作用，得到了較多的還原糖。但過高的NaOH 濃度會(huì)產(chǎn)生發(fā)酵抑制物[16]，并會(huì)抑制纖維素酶的活性。因此，確定最佳NaOH 濃度為4 %。

圖1 不同NaOH 濃度對酶解效果的影響Fig.1 The effect of different NaOH concentrations on the saccharication

3.2 固液比對酶解效果的影響

固定NaOH 濃度為4 %，加熱時(shí)間為30 min，考察固液比1:5、1:8、1:10、1:20、1:30 對酶解效果的影響（見圖2）。由圖2 可知，隨著固液比的增加，還原糖得率有所變化，但酶解72 h 的還原糖得率相差較小，這是因?yàn)楣桃罕鹊淖兓瘜δ举|(zhì)纖維素的分解起著至關(guān)重要的作用[17]。在相同堿液濃度下，固液比越小，在短時(shí)間內(nèi)就可以使得木質(zhì)素和半纖維素充分溶解，而固液比越大，水解時(shí)間就會(huì)加長。可見在較短的時(shí)間內(nèi)，固液比為1：10 時(shí)葡萄糖得率最高。綜合考慮在后續(xù)的發(fā)酵提取工藝中發(fā)生的高額處理費(fèi)，故選用固液比為1：10。

3.3 加熱時(shí)間對酶解效果的影響

在NaOH 濃度質(zhì)量為4 %，固液比為1:5 的條件下，分別用蒸汽加熱2 min、5 min、10 min、20 min、30 min來考察時(shí)間對酶解效果的影響（見圖3）。由圖3 可以看出，隨著加熱時(shí)間的增加，還原糖產(chǎn)量增加，加熱時(shí)間為5 min 玉米秸稈的還原糖產(chǎn)量增加趨勢較其他明顯，酶解72 h 還原糖得率最大達(dá)到56 %；加熱時(shí)間繼續(xù)增加（＞5 min），還原糖得率將呈下降趨勢。這是因?yàn)楦邷丶訜崮芗铀倨茐慕斩捓w維素的結(jié)晶度，使秸稈纖維結(jié)構(gòu)疏松，加速木質(zhì)素的溶解，提高了秸稈的預(yù)處理效率。但是隨著加熱時(shí)間的增加，玉米秸稈在堿性環(huán)境中產(chǎn)生了抑制后續(xù)發(fā)酵的副產(chǎn)物，如乙酸、糠醛等，從而影響葡萄糖得率[18]。因此，確定加熱時(shí)間為5 min。

圖2 固液比對酶解效果的影響Fig.2 The effect of different solid-liquid mass ratios on the saccharication

圖3 加熱時(shí)間對酶解效果的影響Fig.3 The effect of different heating time on the saccharication

3.4 玉米秸稈預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

為了找出最適宜的預(yù)處理?xiàng)l件組合，在確定各預(yù)處理單因子對玉米秸稈酶解糖化效果影響的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的正交試驗(yàn)。采用L9（33）正交表考察各因素之間的相互作用，得到9 個(gè)正交試驗(yàn)組，試驗(yàn)結(jié)果（見表1）。由表可知，酶解液中還原糖的含量最高為56 %時(shí)，最佳預(yù)處理?xiàng)l件為6 %NaOH，固液比1:10，加熱時(shí)間5 min。3 因素對玉米秸稈改性的影響順序（見表1）：RB＞RA＞RC，固液比＞NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞加熱時(shí)間，相應(yīng)的其最佳改性條件為B2A3C2，即固液比為1:8，NaOH 濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %，蒸汽時(shí)間為5 min。以固液比為1:10，NaOH 濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %，加熱時(shí)間為5 min 進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，酶解糖得率為57 %，高于正交試驗(yàn)表中的所有試驗(yàn)。

3.5 玉米秸稈預(yù)處理前后組分分析

對玉米秸稈預(yù)處理前后纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量進(jìn)行測定，結(jié)果（見表2）。從表2 中可以看出，改性后玉米秸稈半纖維素和木質(zhì)素的相對含量分別從25.42 %降低到15.48 %，12.46 %降低到1.99 %，而纖維素相對含量從36.28 %升高到66.98 %?？梢?，半纖維素是堿溶性的，隨著堿濃度的增大，溶出量也逐漸增大；部分木質(zhì)素也是堿溶性的，經(jīng)過預(yù)處理后，纖維素的相對含量增加，這有利于纖維素酶與底物的接觸，從而促進(jìn)酶解作用，糖化率得到了提高。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The result of orthogonal experiment

表2 預(yù)處理前后玉米秸稈的化學(xué)組成Tab.2 The chemical composition of maize stalk with and without pretreatment

3.6 SEM 分析

NaOH 處理前后玉米秸稈的掃描電鏡（SEM）圖（見圖4），由圖可以看出，預(yù)處理前玉米秸稈表面光滑密實(shí)，而經(jīng)堿/高溫濕熱法預(yù)處理后的玉米秸稈表面變得相對膨松粗糙，具有較多不規(guī)則褶皺，增大了比表面積，使得纖維素酶與底物充分接觸，促進(jìn)了酶解作用，提高了糖化率。

圖4 SEM 圖Fig.4 Scanning electron micrographs

4 結(jié)論

本研究采用堿/蒸汽對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，考察NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、固液比和蒸汽加熱時(shí)間等因素對發(fā)酵后葡萄糖得率的影響。試驗(yàn)選擇單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，對預(yù)處理的條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的NaOH 處理效果較好，葡萄糖得率較高；酶解72 h 后，固液比對酶解糖得率影響甚微；蒸汽加熱為5 min 時(shí)，葡萄糖得率較高。通過正交試驗(yàn)可知，堿/蒸汽水解玉米秸稈纖維素的適宜條件：NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %，固液比為1:10，加熱5 min。在此條件下，酶解液中還原糖含量較高。預(yù)處理前后玉米秸稈的組分含量及SEM 證明，處理后的玉米秸稈木質(zhì)素和半纖維素的相對含量有所減少，而纖維素相對含量顯著增加；說明經(jīng)過堿/蒸汽高溫預(yù)處理后的玉米秸稈結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，增加了與纖維素酶的接觸面積，從而提高了酶解糖得率。