反射性共聚焦顯微鏡對早期蕈樣肉芽腫定位診斷與療效監(jiān)測的研究

朱蒙燕 虞聞仲 王平 劉嬌 黎釗 戴輝 許愛娥

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院皮膚科310009；2杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科310009

蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）是最常見的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，早期診斷并采取合適的治療手段對其預(yù)后具有重要意義。表現(xiàn)為非曝光部位多發(fā)性、持久性斑片和斑塊的臨床疑似MF 病例，需要病理學(xué)檢查來明確診斷，但多數(shù)情況下因缺少MF病理學(xué)特征而難以確診，臨床上需多次活檢，給患者帶來一定的痛苦與不便。另外，對于MF 的治療后隨訪及療效觀察，目前多是基于傳統(tǒng)的皮損肉眼觀察，缺少簡捷易操作的客觀指標(biāo)。由于早期MF 的病理特征主要發(fā)生在表皮至真皮淺層，而反射式共聚焦顯微鏡（reflectance confocal microscopy，RCM）作為一種無創(chuàng)、原位、實時、動態(tài)三維的計算機(jī)斷層成像技術(shù)，可觀察到皮膚表皮及真皮淺層結(jié)構(gòu)，已在色素性、炎癥性和腫瘤性皮膚病診斷中得到廣泛應(yīng)用，故可嘗試將RCM 運(yùn)用于MF 的診斷與監(jiān)測［1?2］。我 們 曾 在 國 內(nèi) 較 早 報 道MF 的RCM 形 態(tài) 學(xué) 特征［3?4］。本研究應(yīng)用RCM 技術(shù)，定位早期疑診MF 的皮損后進(jìn)行皮損活檢，探討其作為病理學(xué)診斷的橋梁價值；同時，對MF 患者治療的靶向皮損進(jìn)行RCM 的形態(tài)學(xué)監(jiān)測，以期為MF療效提供一種較為客觀的動態(tài)監(jiān)測指標(biāo)。

一、研究對象

2014年1月至2018年1月在杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科門診收集的臨床疑診為MF 的患者40 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生于非曝光部位的多發(fā)性、持久性斑片/斑塊，病程半年以上，伴或不伴有瘙癢，并排除其他紅斑鱗屑性皮膚病如銀屑病或其他慢性炎癥性皮膚病如扁平苔蘚、玫瑰糠疹等。40例疑診MF 患者中，男26 例，女14 例，年齡19～83（47.0 ±17.6）歲，病程（6.16±6.41）年。本研究已取得杭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署相關(guān)知情同意書。

二、MF的RCM特征及病理診斷標(biāo)準(zhǔn)

1. RCM 特征：見表1。結(jié)合以往文獻(xiàn)、操作經(jīng)驗以及MF 病理特征，總結(jié)MF 的RCM 特征［4?6］。典型或疑似MF 的RCM特征中至少符合2條即可擬診MF，無或僅有極輕微上述改變則排除MF。

2. 早期MF 的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)［7?8］：見表2。典型或疑似MF皮損的病理表現(xiàn)中至少符合2條即可診斷MF，無或僅有極輕微上述改變則排除MF。

三、方法

1.皮損RCM和組織病理學(xué)檢查：根據(jù)總結(jié)的RCM診斷標(biāo)準(zhǔn)，使用RCM（vivascope1500，美國Lucid Inc公司）成像系統(tǒng)對40例疑診MF患者的典型皮損和正常皮膚進(jìn)行逐層掃描成像，記錄相對應(yīng)的RCM 特征分類結(jié)果，并篩選出患者的疑診部位，行定位診斷。同時對疑診部位行組織病理和必要的免疫組化檢查，得出對應(yīng)的病理診斷。根據(jù)病理檢查結(jié)果和免疫組化檢查結(jié)果確診早期MF，并對確診病例再次行RCM檢查，進(jìn)一步總結(jié)MF的RCM特征，并與相應(yīng)的病理特征進(jìn)行比對。

2. 治療及隨訪：確診MF 患者均接受窄譜中波紫外線（NB?UVB）和重組人干擾素（IFN）?α?2b治療。NB?UVB起始劑量為500 mJ/cm2，根據(jù)皮膚的反應(yīng)情況增加或減少劑量，增減劑量以10%～20%為宜，次數(shù)可增加至隔天1 次，直至皮膚微紅則維持該劑量照射，最大劑量不超過2.0 J/cm2，30 次為1 個療程，之后維持治療，每1 ～2 周照射1 次，如果病情反復(fù)，可采取重復(fù)治療；IFN?α?2b用法為300萬IU肌內(nèi)注射，2～3次/周，癥狀明顯緩解后，逐漸減至每周1次肌內(nèi)注射，維持3 ～6個月，平均治療時間9個月。治療開始后每月對同一皮損行RCM 檢查并記錄臨床皮損和RCM 特征的變化等，至第9 個月時進(jìn)行療效判斷。療效評價標(biāo)準(zhǔn)［9］：①完全緩解，治療區(qū)域皮損消退>95%；②部分緩解，皮損消退50%～95%；③無效，皮損消退<50%，或皮損復(fù)發(fā)。

表2 早期蕈樣肉芽腫的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)

3. 統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。采用一致性檢驗和卡方檢驗分析RCM 結(jié)果和皮膚病理檢查結(jié)果之間的相關(guān)性，若Kappa 系數(shù)大于0，說明研究對象之間存在一定的一致性，Kappa 系數(shù)越接近1，一致性越高。P ≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

四、結(jié)果

1.病理診斷及RCM 特征分類結(jié)果：見表3。一致性分析顯示，RCM 特征分類與病理診斷結(jié)果的Kappa 系數(shù)為0.848，P<0.01，具有很強(qiáng)的一致性。

12 例病理確診的MF 患者中，男7 例，女5 例，年齡（41.92±18.09）歲，病程（4.67±5.72）年。其中ⅠA期4例，ⅠB 期4 例，ⅡA 期4 例，均為早期。RCM 疑似但病理確診的4例患者中男女各2例，ⅠA期和ⅠB期各2例，病程最短0.5年，最長5年，皮損表現(xiàn)為軀干或下肢的紅斑。見圖1。

表3 臨床疑似蕈樣肉芽腫（MF）皮損病理診斷與反射式共聚焦顯微鏡特征分類結(jié)果

2. 確診MF 病例RCM 與病理特征對應(yīng)情況：見表4 及圖2。RCM與組織病理學(xué)特征之間表皮淋巴細(xì)胞浸潤的相關(guān)性最高（Kappa系數(shù)=1，P=0.005），其次是紅斑期的真皮纖維化（Kappa 系數(shù)= 0.714，P = 0.035）。斑塊期MF 表皮Pautrier 微膿腫、真皮淋巴細(xì)胞浸潤及纖維化在RCM 和組織病理之間具有中等的一致性（Kappa 系數(shù)均為0.500，均P>0.05）；紅斑期表皮混亂、真皮及血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤（Kappa系數(shù)分別為0.385、0.250、0.333，均P>0.05）和斑塊期真皮淋巴細(xì)胞浸潤（Kappa 系數(shù)=0.200，P=0.505）僅有一般的一致性；斑塊期真皮及紅斑期血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤（Kappa 系數(shù)分別為-0.143、-0.330，P 值分別為0.686、0.505）無一致性。

3.療效及隨訪：12 例MF 確診病例中，2 例在首次注射IFN?α?2b后出現(xiàn)輕微流感樣反應(yīng)、低熱，繼續(xù)治療后，1例不良反應(yīng)在3 周左右消失，另1 例4 周后消失，此后治療過程中均未再出現(xiàn)不良反應(yīng)。12例MF病例經(jīng)過9個月治療，完全緩解7例，部分緩解4例，無效1例。所有病例經(jīng)平均30次照射治療，皮損狀況明顯好轉(zhuǎn)，斑塊、斑片逐漸消退，瘙癢減輕，外觀皮膚平均恢復(fù)時間為3個月。

皮損的RCM 特征隨著治療進(jìn)行，逐步恢復(fù)正常，Pautrier 微膿腫在治療后第1 個月即消失，棘層及基底層結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，表皮至真表皮交界處非典型淋巴細(xì)胞數(shù)量及范圍減少，樹突細(xì)胞、真皮乳頭環(huán)折光逐漸恢復(fù)，血管周圍浸潤現(xiàn)象減輕；至臨床皮損完全緩解時，非典型淋巴細(xì)胞依然存在。見圖3。

五、討論

早期MF無論是臨床還是病理學(xué)上均缺乏特征性表現(xiàn)，導(dǎo)致實現(xiàn)早期診斷和鑒別診斷均較困難。傳統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查是診斷MF的金標(biāo)準(zhǔn)，常需根據(jù)臨床經(jīng)驗對多處病變部位進(jìn)行多次活檢以明確診斷。作為一種有創(chuàng)操作，組織病理學(xué)檢查耗時較長，無法及時反映病情變化，導(dǎo)致MF 的早期診斷及動態(tài)監(jiān)測存在一定困難。本研究中我們在2014年1月至2018年1月期間收集40例MF疑診患者，其中經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為MF 病例12 例，可見臨床初始診斷結(jié)果偏差較大。

表4 紅斑期及斑塊期蕈樣肉芽腫的反射式共聚焦顯微鏡（RCM）及病理特征比較（例）

圖1 反射式共聚焦顯微鏡分類為疑似蕈樣肉芽腫（MF）但病理確診為MF的4例患者臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)（HE×200）及反射式共聚焦顯微鏡（RCM）（0.5 mm×0.5 mm）特征 例1和例4為ⅠA期皮損，例2和例3為ⅠB期皮損；例1病理表現(xiàn)為Pautrier微膿腫和表皮、真皮乳頭環(huán)及血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤，RCM顯示表皮及真表皮交界處少量淋巴細(xì)胞浸潤；例2病理表現(xiàn)為表皮海綿水腫，蜂巢狀結(jié)構(gòu)丟失，表皮至真皮淋巴細(xì)胞浸潤，RCM顯示表皮結(jié)構(gòu)較亂，表皮少量淋巴細(xì)胞浸潤；例3病理表現(xiàn)為表皮海綿水腫，蜂巢狀結(jié)構(gòu)丟失，表皮至真皮及血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤，RCM顯示表皮至真皮少量淋巴細(xì)胞浸潤；例4病理表現(xiàn)為表皮海綿水腫，蜂巢狀結(jié)構(gòu)丟失，表皮至真皮及血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤，真皮亦有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，RCM顯示表皮至真皮少量淋巴細(xì)胞浸潤

圖2 蕈樣肉芽腫組織病理學(xué)特點及相應(yīng)的反射式共聚焦顯微鏡（RCM）特征 2A（HE×200）、2B：表皮結(jié)構(gòu)混亂；2C（HE×400）、2D：Pautrier微膿腫；2E（HE×200）、2F：乳頭環(huán)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤；2G（HE×200）、2H：表皮至真皮淋巴細(xì)胞浸潤

圖3 早期蕈樣肉芽腫患者首診及治療后的臨床表現(xiàn)及反射式共聚焦顯微鏡（RCM）表現(xiàn) 例1 首診時背部大片紅色斑片伴少許鱗屑（3A），RCM可見表皮結(jié)構(gòu)混亂（3B）；9個月后皮損基本恢復(fù)正常（3C），RCM可見表皮結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（3D）。例2首診時上肢散在色素加深斑片及斑塊（3E），RCM可見大量圓形或橢圓形高折光細(xì)胞（3F）；2個月后斑塊變薄，斑片顏色變淡（3G），RCM可見少量圓形或橢圓形高折光細(xì)胞（3H）

臨床中RCM 已應(yīng)用于皮膚腫瘤及銀屑病等常見皮膚病的診斷及鑒別診斷，Yeager 等［10］、Fabbrocini 等［11］目前已將RCM 用于MF 及毛囊型MF 的診斷，但未大規(guī)模應(yīng)用，且不能確定不同分期MF的RCM特征。本次研究證實，MF的RCM 特征分類結(jié)果與組織病理檢查結(jié)果具有一定的一致性，本研究中與病理表現(xiàn)吻合度較高的MF 皮損RCM 特征有表皮至真皮淋巴細(xì)胞浸潤、表皮結(jié)構(gòu)混亂、血管周圍及乳頭環(huán)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤等。但國內(nèi)外關(guān)于RCM 特征的描述不盡相同，如表皮內(nèi)低折光的圓形至橢圓形細(xì)胞聚集形成的囊泡樣結(jié)構(gòu)（即為病理上的Pautrier 微膿腫）在既往研究中出現(xiàn)的概率為20%～73.7%［3，12?13］，本研究中發(fā)生概率也不高，更多的是表皮、表真皮交界處及真皮淋巴細(xì)胞浸潤，因此我們認(rèn)為該特點應(yīng)為MF 最重要的RCM 特征。另外，本研究中RCM特征符合MF的病例為8例，最終結(jié)果全部與病理診斷結(jié)果一致，提示RCM 技術(shù)可對疑診MF 的皮損進(jìn)行準(zhǔn)確定位后活檢，有效減少活檢次數(shù)，并在隨訪過程中實現(xiàn)除肉眼觀察以外的一種較客觀的動態(tài)監(jiān)測方式。4 例RCM疑似、病理確診病例的病程較短，多處于Ⅰ期，臨床上極有可能會對此類MF 病例漏診或誤診，因此若先使用RCM對臨床疑診MF病例進(jìn)行初篩，有助于確定最終診斷。

NB?UVB 聯(lián)合IFN?α?2b 注射治療是MF 經(jīng)典有效的治療方法［14?15］。我們此前研究也證實，NB?UVB聯(lián)合IFN?α?2b比NB?UVB單獨治療MF療效更佳，是一種安全有效的治療方法［16］。12例MF經(jīng)過NB?UVB和IFN聯(lián)合治療后，11例完全或部分緩解，再次證明該方案的有效性。在隨訪過程中MF 的RCM 特征逐步恢復(fù)正常，表皮至真表皮交界處非典型淋巴細(xì)胞數(shù)量及范圍減少，Pautrier 微膿腫第1 個月即消失。由此可見，RCM 能夠較客觀便捷地對MF 療效實施動態(tài)監(jiān)測。

總之，MF在RCM下有特征性表現(xiàn)，并與病理診斷具有一致性。在MF早期，RCM可以作為縮小活檢范圍、減少活檢次數(shù)的輔助篩選手段及早期MF輔助診斷手段，在治療期間RCM可作為一種較客觀的療效評估工具。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突