鼻淵舒口服液對CRS模型小鼠鼻竇黏膜IFN-γ及免疫檢查點B7-H1/PD-1 mRNA表達的影響研究

付譯節(jié) 李輝 朱天民 朱鑫 李璐 胡守亮

摘 要 目的：探討鼻淵舒口服液對慢性鼻-鼻竇炎（CRS）模型小鼠γ干擾素（IFN-γ）的影響，并基于協(xié)同刺激分子B7同源物l（B7-H1）/程序性死亡因子1（PD-1）免疫檢測點探討其可能機制。方法：將雄性C57小鼠隨機分為正常組、假手術組、化學藥對照組（克拉霉素，103 mg/kg）和鼻淵舒低、中、高劑量組（鼻淵舒口服液，3.1、6.2、12.4 mL/kg），每組20只。除正常組不作任何處理外，其余各組小鼠均開放上頜竇，假手術組不填充帶菌海綿，模型組和各給藥組填充帶菌海綿以復制CRS模型。自造模后第8周開始，正常組、假手術組和模型組小鼠均灌胃生理鹽水0.2 mL，各給藥組小鼠灌胃相應藥物，每日1次，連續(xù)14 d。觀察小鼠的鼻部癥狀和一般情況，采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠鼻竇黏膜的病理變化;采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測小鼠鼻竇黏膜中IFN-γ、B7-H1、PD-1 mRNA的表達情況。結果：正常組、假手術組小鼠未見鼻部異常，鼻竇黏膜上皮及纖毛完整，兩組IFN-γ、B7-H1、PD-1 mRNA的相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組小鼠可見流涕且頻繁撓鼻、噴嚏，鼻腔內(nèi)有少量黃色分泌物，脫毛嚴重;其鼻竇黏膜嚴重缺損、纖毛脫落，黏膜下層腺體增生，可見淋巴細胞浸潤;鼻竇黏膜中IFN-γ、B7-H1、PD-1 mRNA的相對表達量均較正常組顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠的鼻部癥狀、一般情況及鼻竇組織病理學變化均有不同程度的改善，化學藥對照組和鼻淵舒中、高劑量組小鼠鼻竇黏膜中IFN-γ、B7-H1 mRNA以及各給藥組PD-1 mRNA的相對表達量均顯著降低，且鼻淵舒中、高劑量上述指標均顯著低于低劑量組，而鼻淵舒高劑量組IFN-γ mRNA的相對表達量顯著高于中劑量組。鼻淵舒低、高劑量組IFN-γ mRNA，低劑量組B7-H1 mRNA以及各劑量組PD-1 mRNA的相對表達量均顯著高于化學藥對照組（P<0.05或P<0.01）;鼻淵舒中劑量組上述指標水平與化學藥對照組相當（P>0.05）。結論：鼻淵舒口服液可改善CRS模型小鼠鼻竇黏膜的慢性炎癥，其機制可能與通過抑制IFN-γ mRNA表達從而干預B7-H1/PD-1 mRNA過度表達有關。

關鍵詞 鼻淵舒口服液;慢性鼻-鼻竇炎;γ干擾素;協(xié)同刺激分子B7同源物l;程序性死亡因子1;免疫檢查點;小鼠;機制

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the effects of Biyuanshu （BYS） oral solution on IFN-γ of chronic rhinosinusitis （CRS） model mice， and to investigate its potential mechanism on the basis of B7-H1/PD-1 immune checkpoint. METHODS： Male C57 mice were randomly divided into normal group， sham operation group， chemical medicine control group （clarithromycin， 103 mg/kg）， BYS low-dose， medium-dose and high-dose groups （BYS oral solution， 3.1， 6.2， 12.4 mL/kg）， with 20 mice in each group. Except for normal group without any treatment， other mice were all open maxillary sinus， sham operation group was not filled with sponge with bacteria， while model group and administration groups were filled with sponge with bacteria to induce CRS model. Since 8th week after modeling， normal group， sham operation group and model group were given normal saline 0.2 mL intragastrically， administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. The nasal symptoms and general condition of mice were observed， and the pathological changes of mices nasal sinus mucosa were observed by HE staining; qRT-PCR was used to measure the mRNA expression of IFN-γ， B7-H1 and PD-1 in nasal sinus mucosa of mice. RESULTS： The normal group and sham operation group had no abnormal in nose， and the epithelium and cilia of the nasal sinus mucosa were intact; there was no significant difference in the relative mRNA expression of IFN-γ， B7-H1 and PD-1 between 2 groups （P>0.05）. In model group， the mice were found to have runny nose， frequent scratching and sneezing， a small amount of yellow secretion in the nasal cavity， and serious depilation; the nasal sinus mucosa was seriously damaged， cilia was exfoliated， and the gland in the submucosa was hyperplasia， lymphocyte infiltration was also found; the relative mRNA expression of IFN-γ， B7-H1 and PD-1 were significantly increased compared with normal group （P<0.01）. Compared with model group， the nasal symptoms， general condition and pathological changes of the nasal sinuses in each administration group were improved in varying degrees; the relative mRNA expression of IFN-γ and B7-H1 in chemical medicine control group， BYS medium-dose and high-dose groups， as well as the relative mRNA expression of PD-1 in administration groups were decreased significantly; above indexes of BYS medium-dose and high-dose groups were significantly lower than BYS low-dose group， while relative mRNA expression of IFN-γ in BYS high-dose group were significantly higher than BYS medium-dose group. The relative mRNA expression of IFN-γ in BYS low-dose and medium-dose groups， the relative mRNA expression of B7-H1 in BYS low-dose group， the relative mRNA expression of PD-1 in BYS groups were significantly higher than chemical medicine control group; mRNA expression of IFN-γ in BYS high-dose group was significantly higher than chemical medicine control group （P<0.05 or P<0.01）. Above indexes of BYS medium-dose group were similar to those of chemical medicine control group （P>0.05）. CONCLUSIONS： BYS oral solution can improve chronic inflammation in nasal sinus mucosa of mice， the mechanism of which may be associated with intervening mRNA overexpression of B7-H1/PD-1 by inhibiting mRNA expression of IFN-γ.

KEYWORDS? ?Biyuanshu oral solution; Chronic rhinosinusitis; IFN-γ; B7-H1; PD-1; Immune checkpoint; Mice; Mechanism

慢性鼻-鼻竇炎（Chronic rhinosinusitis，CRS）是由環(huán)境因素、微生物感染、變態(tài)反應等多因素所導致的鼻腔和鼻竇黏膜慢性持續(xù)性炎癥。目前，CRS的治療措施雖有較大改進，但復發(fā)率仍較高，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量[1]。因此，研究CRS發(fā)病機制和相關藥物作用機制成為鼻科領域的熱點方向之一[1]。臨床研究顯示，鼻淵舒口服液治療CRS的效果較好，但相關機制尚不完全清楚[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，Th1細胞因子γ干擾素（IFN-γ）參與了CRS鼻-鼻竇黏膜炎癥細胞活化及炎癥損傷過程[4-6]，且該因子參與調(diào)控的協(xié)同刺激分子B7同源物l（B7-H1）是機體防止免疫應答過度致炎癥損傷擴大的免疫檢查點的關鍵分子[7]。程序性死亡因子1（PD-1）是B7-H1的受體，兩者結合后可進一步抑制活化的T淋巴細胞，延遲T細胞免疫應答，在CRS的發(fā)生過程中有重要作用[8]?；诖?，本研究從IFN-γ及其調(diào)控的B7-H1/PD-1免疫檢查點出發(fā)，初步探討了鼻淵舒口服液對CRS模型小鼠上述因子mRNA表達的影響，為該藥治療CRS的免疫調(diào)節(jié)機制及其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BA310型病理顯微圖像分析系統(tǒng)[麥克奧迪（廈門）醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司];NanoDrop ND-2000型超微量分光光度計、Micro 17R型冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）;FTC 3000型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（加拿大Funglyn Biotech公司）;RM2265型切片機（德國Leica公司）;SAESHIN 207A-107型牙科打磨機（東莞耐信五金有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鼻淵舒口服液（成都泰合健康科技集團股份有限公司華神制藥廠，批號：20121010，規(guī)格：每支裝10 mL）;克拉霉素片[陽性對照，重慶科瑞制藥（集團）有限公司，批號：562002，規(guī)格：0.125 g];水合氯醛（成都科龍化工試劑廠，批號：20120611）;TRIzol試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：15596026）;實時熒光定量PCR試劑盒（含TB GreenPremix Ex TaqⅡ等試劑，日本Takara公司，批號：RR086B）;PCR擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計、合成（序列見表1）;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0105）;氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：H12111906，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g，作生理鹽水用）;綿羊血清（鄭州九龍生物制品有限公司）;Luria Broth液體培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術有限公司）;其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級雄性C57小鼠140只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由四川大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-026。所有小鼠均飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物研究室內(nèi)。本研究動物實驗方案遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關要求[9]。

1.4 細菌

肺炎鏈球菌（ATCC 49619）由上海川翔生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

所有小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為7組，即正常組、假手術組、模型組、化學藥對照組和鼻淵舒低、中、高劑量組，每組20只。除正常組外，其余各組小鼠均參考文獻方法[10]開放上頜竇：腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉并消毒后，于小鼠鼻背正中處作長約3 mm的橫行切口，鈍性分離皮下組織，暴露鼻背上頜竇腔骨質(zhì)，在左右兩側用打磨機各打磨1個直徑約1 mm的小孔。模型組和各給藥組于此竇腔植入含肺炎鏈球菌菌液的醫(yī)用膨脹海綿（將大小約1 mm3的海綿置于6×108 CFU/mL菌液中浸泡至飽和，菌液由含10%綿羊血清的Luria Broth液體培養(yǎng)基配制）后，常規(guī)縫合;假手術組不填充帶菌海綿;正常組小鼠不作任何處理。

自造模后第8周開始，正常組、假手術組和模型組小鼠均灌胃生理鹽水0.2 mL，化學藥對照組小鼠灌胃克拉霉素103 mg/kg（以生理鹽水為溶劑，劑量設置參考已有文獻[11]并進行換算[12]而得），鼻淵舒低、中、高劑量組小鼠均灌胃鼻淵舒口服液3.1、6.2、12.4 mL/kg（劑量設置參考已有文獻[3]并進行換算[12]而得），每日1次，連續(xù)14 d。

2.2 小鼠鼻部癥狀和一般情況觀察

每日觀察各組小鼠噴嚏、撓鼻、鼻腔分泌物等鼻部癥狀和皮毛、活躍狀態(tài)等一般情況。

2.3 小鼠鼻竇黏膜病理學觀察

末次給藥后，將各組小鼠麻醉、處死，取鼻竇黏膜組織適量，于10%中性甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片（厚度約5 μm），行HE染色，置于病理顯微圖像分析系統(tǒng)下觀察鼻竇黏膜上皮細胞排列及淋巴細胞等炎癥細胞浸潤等情況。

2.4 小鼠鼻竇黏膜中IFN-γ、B7-H1、PD-1 mRNA表達情況檢測

另取“2.3”項下各組小鼠鼻竇黏膜組織適量，用TRIzol試劑提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性、超微量分光光度計測定RNA濃度后，以總RNA為模板反轉錄為cDNA，再參考實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。反應體系（共25 μL）： cDNA模板2 μL，TB GreenPremix Ex TaqⅡ 12.5 μL，10? μmol/L正/反向引物各1 μL，滅菌水8.5 μL。反應條件：94 ℃預變性120 s;94 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，60 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法以FTC-3000 v4.0軟件計算各目標基因mRNA的相對表達量。上述試驗重復3次。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 小鼠鼻部癥狀和一般情況

造模前各組小鼠鼻部未見異常，皮毛光滑，精神狀態(tài)良好。造模8周后（給藥前），模型組和各給藥組小鼠均可見流涕、頻繁撓鼻、噴嚏，鼻腔內(nèi)有少量黃色分泌物，脫毛嚴重;正常組和假手術組小鼠均未見鼻部異常，皮毛光滑。經(jīng)藥物干預14 d后，鼻淵舒低、高劑量組小鼠偶爾有噴嚏;鼻淵舒中劑量組和化學藥對照組小鼠無噴嚏、撓鼻，鼻腔未見明顯分泌物，脫毛處有新生毛發(fā);模型組小鼠上述癥狀均未見改善。在實驗期間，模型組和鼻淵舒低、高劑量組各2只，鼻淵舒中劑量組1只，假手術組、化學藥對照組各3只（共計13只小鼠）因手術損傷或肺部感染死亡。

3.2 小鼠鼻竇黏膜病理學變化

正常組和假手術組小鼠鼻竇黏膜上皮及纖毛完整，黏膜下層偶見少量淋巴和杯狀細胞。模型組小鼠鼻竇黏膜嚴重缺損、纖毛脫落，黏膜下層腺體增生，可見淋巴細胞浸潤，提示CRS模型復制成功。鼻淵舒低劑量組小鼠鼻竇黏膜病理表現(xiàn)與模型組相似;鼻淵舒高劑量組和化學藥對照組小鼠部分鼻竇黏膜有壞死脫落，部分黏膜下層存在淋巴細胞等炎癥細胞浸潤和腺體增生，但較模型組減輕;鼻淵舒中劑量組小鼠鼻竇黏膜與正常組相似，黏膜及纖毛較完整，黏膜下層淋巴細胞少見，詳見圖1。

3.3 小鼠鼻竇黏膜中IFN-γ、B7-H1、PD-1 mRNA表達變化

與正常組比較，假手術組小鼠鼻竇黏膜中IFN-γ、B7-H1、PD-1 mRNA的相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;模型組小鼠上述因子mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，化學藥對照組和鼻淵舒中、高劑量組小鼠鼻竇黏膜中IFN-γ、B7-H1 mRNA以及各給藥組PD-1 mRNA的相對表達量均顯著降低;鼻淵舒中、高劑量組IFN-γ、B7-H1、PD-1 mRNA的相對表達量均顯著低于低劑量組，鼻淵舒高劑量組IFN-γ mRNA的相對表達量顯著高于中劑量組。鼻淵舒低、高劑量組IFN-γ mRNA，低劑量組B7-H1 mRNA和各劑量組PD-1 mRNA的相對表達量均顯著高于化學藥對照組（P<0.05或P<0.01）;鼻淵舒中劑量組上述指標與化學藥對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表2。

4 討論

CRS是由多種因素導致的鼻腔及鼻竇黏膜慢性持續(xù)性炎癥，患者治療后的復發(fā)率較高[1]。鼻淵舒口服液由辛荑、薄荷、蒼耳子、白芷、黃芪、黃芩、梔子等藥材組成，具疏風清熱、祛濕通竅等功效，且臨床研究指出其單用或與其他藥物聯(lián)用均對CRS具有較好的療效，但具體作用機制尚未闡明[2-3]。目前，在西醫(yī)治療方面，克拉霉素因其具有與皮質(zhì)類固醇相似的抑制炎癥細胞因子表達的作用，且不會引起免疫抑制，同時還能提高CRS患者的內(nèi)鏡和電子計算機斷層掃描（CT）評分，現(xiàn)已成為臨床治療CRS的推薦用藥[13-14]?；诖?，本研究選用克拉霉素為陽性對照藥物，以CRS模型小鼠為對象，初步探討了鼻淵舒口服液治療CRS的可能機制。

本研究結果顯示，造模前各組小鼠鼻部均未見明顯異常，且皮毛光滑、精神狀態(tài)良好。造模后，小鼠出現(xiàn)流涕、頻繁撓鼻、噴嚏等癥狀;模型組小鼠鼻竇黏膜缺損、纖毛脫落，黏膜下層腺體增生、淋巴細胞浸潤，與Jacob A等[10]報道的CRS模型小鼠鼻竇黏膜病理表現(xiàn)一致，提示CRS模型復制成功。經(jīng)藥物干預后，各給藥組小鼠上述癥狀均有不同程度改善;除鼻淵舒低劑量組外，鼻淵舒中、高劑量組和化學藥對照組小鼠鼻竇黏膜缺損脫落、黏膜下層淋巴細胞等炎癥細胞浸潤和腺體增生等慢性炎癥表現(xiàn)均有明顯改善，提示中、高劑量鼻淵舒口服液和克拉霉素均可改善CRS模型小鼠鼻竇黏膜的慢性炎癥，對該癥具有一定的治療作用。

IFN-γ是主要的Th1細胞因子，屬Ⅱ型干擾素，除具有抗病毒、抗腫瘤細胞增殖的作用外，還具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，可通過干擾與免疫有關的基因轉錄從而調(diào)控免疫應答，同時還能激活淋巴細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞等，促進巨噬細胞發(fā)揮吞噬及抗原提呈的作用[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，CRS患者鼻竇黏膜中的IFN-γ呈高表達，提示該因子可能參與了CRS發(fā)生時鼻竇黏膜炎癥細胞活化及炎癥損傷的過程[5-6]。本研究結果顯示，模型組小鼠鼻竇黏膜中存在淋巴細胞浸潤等炎癥反應，其鼻竇黏膜中IFN-γ mRNA的相對表達量較正常組顯著升高，提示IFN-γ可能參與了CRS模型小鼠鼻竇黏膜中淋巴細胞等慢性炎癥細胞的活化。經(jīng)藥物作用后，化學藥對照組和鼻淵舒中、高劑量組IFN-γ mRNA的相對表達量均較模型組顯著降低;但鼻淵舒高劑量組顯著高于中劑量組，低、高劑量組顯著高于化學藥對照組，提示中、高劑量鼻淵舒口服液可不同程度地抑制小鼠IFN-γ mRNA的表達，且中劑量鼻淵舒口服液的作用與化學藥對照組相當。值得注意的是，鼻淵舒口服液在影響小鼠鼻竇黏膜中IFN-γ mRNA表達方面，各劑量的量效關系并不明顯，有待后續(xù)研究進一步探討。

有研究發(fā)現(xiàn)，為避免免疫應答過度導致炎癥反應損傷擴大，機體形成了免疫檢查點機制，以控制免疫反應的強度和持續(xù)時間、減少過度炎癥反應對機體組織造成損傷[7]。B7-H1是協(xié)助T淋巴細胞免疫應答的一種協(xié)同刺激分子[15-16]，其與PD-1構成B7-H1/PD-1免疫檢查點，起著調(diào)節(jié)T淋巴細胞免疫應答的作用[7]。當T細胞活化時，B7-H1與細胞表面的PD-1結合，后者的免疫受體酪氨酸轉換基序的Tyr被磷酸化，進一步召集蛋白酪氨酸磷酸酶，從而促使磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、脾酪氨酸激酶（Syk）等下游激酶發(fā)生去磷酸化，導致蛋白激酶B（PKB）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）等通路的活化受到抑制，從而使得T細胞活化及炎癥細胞因子分泌受阻，T細胞免疫應答被抑制，最終發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應和免疫耐受的作用[17-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1/PD-1免疫檢查點與慢性炎癥的遷延有關：當慢性炎癥發(fā)生時，效應T淋巴細胞等產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子，后者可誘導B7-H1、PD-1等存在于T淋巴細胞及其效應細胞細胞膜上的協(xié)同刺激分子表達上調(diào)，激活B7-H1/PD-1免疫檢查點，使T淋巴細胞免疫應答被抑制、病原不能被徹底清除，最終導致炎癥遷延不愈[21-22]。張魯平等[8]發(fā)現(xiàn)，B7-H1、PD-1在CRS患者鼻竇黏膜中表達增加，可能是CRS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。

本研究結果顯示，模型組小鼠鼻竇黏膜中B7-H1、PD-1 mRNA的相對表達量均較正常組顯著升高，提示CRS發(fā)生時，小鼠鼻竇黏膜中可能存在B7-H1/PD-1免疫檢查點基因過表達，有抑制T細胞免疫應答、引起炎癥遷延的可能。經(jīng)藥物作用后，鼻淵舒中、高劑量組B7-H1 mRNA和鼻淵舒各劑量組PD-1 mRNA的相對表達量均較模型組顯著降低，且鼻淵舒中、高劑量組B7-H1、PD-1 mRNA的相對表達量均顯著低于低劑量組，提示不同劑量的鼻淵舒口服液均可通過不同程度地抑制小鼠鼻竇黏膜中B7-H1/PD-1 mRNA的過表達來發(fā)揮對CRS的改善作用，且中、高劑量的作用更強。

有研究發(fā)現(xiàn)，在B7-H1編碼基因啟動子區(qū)存在IFN-γ調(diào)節(jié)位點[23-24]，IFN-γ是誘導B7-H1表達的重要炎癥因子，可通過誘導鼻黏膜上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和基質(zhì)細胞分泌B7-H1來調(diào)節(jié)鼻黏膜局部T細胞免疫[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠IFN-γ、B7-H1 mRNA的相對表達量均顯著高于正常組，推測小鼠鼻竇黏膜中B7-H1 mRNA表達的升高可能與IFN-γ誘導有關;同時，在鼻淵舒不同劑量組中，IFN-γ、B7-H1 mRNA的表達均有不同程度的下降，推測鼻淵舒口服液抑制B7-H1/PD-1 mRNA過表達可能與其抑制IFN-γ mRNA表達有關。

綜上所述，鼻淵舒口服液可改善CRS模型小鼠鼻竇黏膜的慢性炎癥，這種作用可能與通過抑制IFN-γ mRNA表達從而干預B7-H1/PD-1 mRNA過表達有關。本課題組后續(xù)將對B7-H1/PD-1免疫檢查點的上/下游調(diào)控因子和相關通路進行深入研究，擬進一步揭示鼻淵舒口服液治療CRS的免疫調(diào)節(jié)機制。

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（收稿日期：2020-02-05 修回日期：2020-06-05）

（編輯：張元媛）