理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠炎癥的干預作用及機制研究

朱 博 陳 攀 王 輝 丁 科

目前冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病是影響人類健康的主要疾病之一，而高脂血癥又是誘導疾病的重要因素，中醫(yī)藥治療高脂血癥得到普遍認可并具有廣泛的前景[1]。Toll 樣受體4（TLR4）的激活與脂多糖（LPS）密切相關(guān)，并啟動炎癥反應(yīng)，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF-6）是TLR4 下游信號分子中重要一環(huán)，在敲除TRAF-6 基因的小鼠中，TLR4 介導的炎癥因子及趨化因子明顯減少[2-3]。本研究采用金黃地鼠作為實驗動物，建立飲食性高脂血癥模型，觀察給藥后造模地鼠血脂生化指標變化，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法分別檢測炎癥因子血清白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量和肝臟組織膽固醇7α 羥化酶（CYP7A1）含量；采用Western blot 檢測和qRT-PCR 檢測觀察理氣化痰祛瘀方對金黃地鼠肝臟組織TTLR4 和TRAF-6 的表達，探討其在TLR4/TRAF-6 信號通路中所起的可能機制和作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 雄性LVG 敘利亞金黃地鼠60只，7 周齡，體質(zhì)量（120±10）g，由北京維通利華公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，實驗動物質(zhì)量合格證號：11400700240693。于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心按屏蔽環(huán)境標準飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室許可證號：SYXK（浙）2013-0184。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 藥品及主要試劑 理氣化痰祛瘀方（浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑室制備提供，批號201708-201711）；非諾貝特（上海衡山藥業(yè)有限公司，批號23267）；生理鹽水（河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號A17021309）；膽固醇（鑫汐生物，批號D12451）；起酥油（車輪牌，批號Q/ZPN0002S）；蛋黃粉（康德蛋業(yè)，批號D12450B）；3 號膽鹽（源業(yè)生物有限公司，批號S31332-100g）；基礎(chǔ)飼料（浙江省醫(yī)科院，批號D110700）；TC、TG 試劑盒（雅培制藥有限公司，批號4818UN16，1206UN16）；LDL-c、HDL-c 試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號92649095，92650099）；IL-6、TNF-α、CYP7A1 ELISA 檢測試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號均為201710）；RIPA 裂解液（碧云天，批號P0013D）；PMSF（Sigma，批號ST505）；蛋白酶抑制劑（碧云天，批號P1005）；BCA 蛋白定量試劑盒（Solarbio，批號pc0020）；HRP標記的二抗（華安生物，批號HA1001-100）；化學發(fā)光檢測試劑（Affinity，批號K001/K002）；預染蛋白marker（Solarbio，批號PR1910）；TLR4（Proteintech，批號19811-1-AP）；TRAF-6（Affinity，批號AF5376）；β-Actin（華安，批號M1210-2）；TRIzon 總RNA 提取試劑（康為世紀，批號CW0580）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，批號639503）；SYBR Green qPCR 試劑盒（Takara，批號RR430S）；無水乙醇（滬試，批號64-17-5）；氯仿（滬試，批號67-66-3）；異丙醇（滬試，批號67-63-0）。

1.3 主要儀器 C16000 型全自動生化檢測儀（美國雅培公司）；NIKON ECLIPSE TI-SR 倒置熒光顯微鏡（日本尼康）；生化培養(yǎng)箱（上海齊欣）；Micro17R 低溫高速離心機（Thermo）；CMaxPius 酶標儀（Spectia-Max）；VE 180C 電泳儀電泳槽（天能）；VE186 轉(zhuǎn)膜儀（天能）；Mastercycler Pro 型PCR 儀（德國EPPENDORF）；5804R 型冷凍離心機（德國EPPENDORF）；CFX-96 touch 實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad）；紫外分光光度計（蘇州島津公司）；自動勻漿器（IKA 公司）。

1.4 動物分組及處理 60 只健康成年雄性LVG 敘利亞金黃地鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，測定各項血脂指標篩選接近正常血脂水平的金黃地鼠，根據(jù)數(shù)字表隨機分配法挑選8 只作為正常組，其余作為造模組，分別喂予普通飼料和高脂飼料（82.5%普通飼料、10%起酥油、2%膽固醇、0.5%3 號膽鹽、5%蛋黃粉）。造模2 周后，禁食12h 采用尾靜脈取血測定TC 含量，篩選TC＞6.76mmol/L 40 只作為高脂血癥模型地鼠。

將成模地鼠根據(jù)數(shù)字表隨機分配法分為五組，即模型組、理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組（6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1）、非諾貝特組（150mg·kg-1·d-1），每組8 只，各組地鼠分別灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，正常組和模型組分別灌服等容量生理鹽水，每天1 次。6 周后解剖金黃地鼠，取肝臟稱重0.2g，加入10 倍磷酸緩沖鹽溶液（PBS），部分制備肝臟勻漿上清液，其余部分置放在-80℃液氮保存。

2 實驗方法

2.1 金黃地鼠血清TC、TG、LDL-c 和HDL-c 生化指標檢測 分別于高脂飼料飼喂第0、2、8 周，空腹禁食12h（不禁水），眼眶采血0.5mL，靜置30min 后，3000 r/min 離心10min，制備血清備用。采用生化分析儀檢測金黃地鼠血清TC、TG、LDL-c 和HDL-c 的含量。

2.2 ELISA 檢測高脂血癥金黃地鼠血清IL-6、TNFα 含量，肝臟組織CYP7A1 含量 給藥后第6 周（飼喂第8 周），空腹禁食12h（不禁水），眼眶采血0.5mL，靜置30min 后，3000r/min 離心10min，制備血清備用；解剖金黃地鼠，取肝臟稱重0.2g，加入10 倍PBS 勻漿，制備肝臟勻漿上清液，嚴格按照試劑盒操作步驟進行。

2.3 Western blot 檢測金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達 肝臟組織加入RIPA 裂解液（含PMSF 和蛋白酶抑制劑） 勻漿，冰上裂解30min，12000rpm 離心5min，取上清。采用二喹啉甲酸（BCA） 法檢測肝臟組織總蛋白濃度，用酶標儀A562nm 波長測定；加入緩沖溶液在沸水浴中變性，5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，分離膠經(jīng)甲醇和轉(zhuǎn)膜液浸濕的聚偏氟乙（PVDF）膜進行蛋白轉(zhuǎn)膜；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5～2h，將膜放入一抗稀釋液平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜，用TBST 洗膜10min×3 次；加入含辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗稀釋液，室溫搖床振蕩反應(yīng)1～2h；用TBST 洗膜10min×3 次。暗室X 線曝光，以β 肌動蛋白（β-Actin）抗體作為內(nèi)參對照，通過比較目標蛋白的灰度值進行半定量分析。

2.4 qRT-PCR 檢測金黃地鼠肝臟組織TLR4、TRAF-6 mRNA 水平 將液氮-80℃速凍保存的樣品用康為世紀公司的Trizol 試劑盒進行總RNA 的提取，具體方法參照說明書。采用分光光度法檢測提取RNA的OD 值并計算濃度，保證RNA 抽提純度和完整性。用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在Realtime PCR 儀上進行PCR 實時熒光反應(yīng)，記錄并分析其mRNA 表達量差異。qRT-PCR 實驗所用引物的序列由上海生工生物工程有限公司提供，TLR4 上游其序列為5'-CTCAGAGAGAGCCAGTGGAA-3'，下游引物序列為5'-GGAGCATTAGTGAACCCTCG-3'；TRAF-6 上游引物序列為5'-CAACTTGTCAGCCCTCCTTT-3'，下游引物序列為5'-TGGAAGAATAGCCAGTGCTCT-3'，GAPDH 上游引物序列為5'-AACAGGGTGGTGGACCTCAT-3'，下游引物序列為5'-TGCTCTCAGTATCCTTGCTG-3'。qPCR 反應(yīng)擴增體系為20μL：2×EvaGreen 擴增混合物（美國Bio-Rad 公司）10μL，前引物1μL，后引物1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。擴增條件：94℃1min；95℃10s 高溫變性、58℃10s、72℃10s 退火/延伸，40 個循環(huán)。

2.5 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（） 表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的LSD 法（最小顯著性法），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠血脂水平的影響 高脂飼喂第8 周（理氣化痰祛瘀方給藥第6 周），與正常組比較，模型組金黃地鼠TC、TG、LDL-c 含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，理氣化痰祛瘀方中、高劑量組和非諾貝特組TC、TG、LDL-c 含量顯著下降（P＜0.05），HDL-c 含量無顯著性差異（P＞0.05）。其中，非諾貝特組TC、TG、LDL-c含量下降程度最高，理氣化痰祛瘀方給藥后TC、TG、LDL-c 含量下降程度高低依次為理氣化痰祛瘀方中、高、低劑量組[4]。見表1。

3.2 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠炎癥因子的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05），肝臟組織CYP7A1含量顯著下降（P＜0.05）。非諾貝特和理氣化痰祛瘀方給藥6 周，與模型組比較，非諾貝特組、理氣化痰祛瘀方中、高劑量組金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 含量顯著下調(diào)，肝臟CYP7A1 含量則顯著上升（P＜0.05）。理氣化痰祛瘀方給藥6 周后金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 含量下降程度高低依次為理氣化痰祛瘀方高、中、低劑量組。見表2。

3.3 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達水平的影響 與正常組比較，模型組金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，非諾貝特組金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組金黃地鼠肝臟組織TLR4 蛋白表達水平和TRAF-6 蛋白表達水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。見表3，圖1。

3.4 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 表達水平的影響 與正常組比較，模型組金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，非諾貝特組金黃地鼠肝臟組織TLR4、TRAF-6 水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組金黃地鼠肝臟組織TLR4、TRAF-6 水平顯著下調(diào)（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。見表4。

4 討論

目前臨床上常用他汀類藥物作為防治心血管疾病的一線藥物，但許多患者對他汀類藥物治療具有耐藥性，最終仍死于心肌梗死或中風[5]。與西藥相比中藥雖然治療高脂血癥機制復雜，但不良反應(yīng)較少。中醫(yī)認為，高脂血癥主要由痰瘀痹阻、臟腑功能不足形成，強調(diào)肝脾失調(diào)是該病的病理基礎(chǔ)，痰瘀是其病變之標，多采用具有祛痰化瘀、升清降濁、補氣活血功效的中藥進行治療[6-7]。理氣化痰祛瘀方由浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院陳芝蕓教授臨床驗方演變而來，由桃仁、山楂、郁金、澤瀉、海藻、象貝、香櫞、萊菔子、茯苓組成，其中生山楂祛瘀消積；茯苓、澤瀉除水濕，消痰濁；桃仁破血逐瘀，與澤瀉配用，分流疏導，使邪有退路；郁金、香櫞疏肝利膽，行氣消痰；海藻、象貝化痰軟堅散結(jié)，以助痰瘀的消除。諸藥合用，痰、濕、瘀、積得除，肝脾功能得調(diào)，氣血壅滯得通，該方經(jīng)過臨床辨證加減，對治療高脂血癥有明顯的療效。

表1 給藥第6 周對高脂血癥模型金黃地鼠血脂水平的影響（mmol/L，）

表1 給藥第6 周對高脂血癥模型金黃地鼠血脂水平的影響（mmol/L，）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TC 為總膽固醇；TG 為三酰甘油；LDL-c 為低密度脂蛋白膽固醇；HDL-c 為高密度脂蛋白膽固醇；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方高劑量組比較，dP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，eP＜0.05

表2 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 及肝臟組織CYP7A1 含量的影響（）

表2 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 及肝臟組織CYP7A1 含量的影響（）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；IL-6 為白細胞介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子α；CYP7A1 為膽固醇7α 羥化酶；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，dP＜0.05

表3 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達水平影響（）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TLR4 為Toll 樣受體4；TRAF-6 為腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6；β-Actin 為β 肌動蛋白；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，dP＜0.05

表4 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平的影響（）

表4 理氣化痰祛瘀方對高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平的影響（）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TLR4 為Toll 樣受體4；TRAF-6 為腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6；β-Actin 為β 肌動蛋白；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，dP＜0.05

文獻表明，脂肪細胞中LPS 作為TLR4 主要配體，可以激活TLR4/NF-κB 信號通路，誘導炎癥發(fā)生，而TRAF-6 作為TLR4 信號通路中最重要的一環(huán)，在促炎及凋亡過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。我們前期研究證明，理氣化痰祛瘀方能有效降低高脂血癥模型金黃地鼠血清血脂水平，TC、TG、LDL-c 含量下降程度高低依次為理氣化瘀方中、高、低劑量組，并在一定程度上能改善高脂血癥金黃地鼠肝臟病理變化程度[10]；實驗還證明，其在一定程度上能恢復高脂血癥金黃地鼠腸道菌群紊亂，改善菌群失衡，重新形成穩(wěn)定的細菌菌群結(jié)構(gòu)[4]；理氣化痰祛瘀方能有效降低高脂血癥金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 含量（P＜0.05），其肝臟組織CYP7A1 含量則顯著上升（P＜0.05），提示理氣化痰祛瘀方可以有效減少IL-6、TNF-α 等炎癥因子的分泌，改善大鼠肝組織的炎癥程度，提高機體對脂質(zhì)的消化吸收及對膽固醇的代謝作用。故筆者認為理氣化痰祛瘀方能有效干預金黃地鼠高脂血癥發(fā)生和發(fā)展，對治療高脂血癥有著積極的意義。

TLR4 作為介導先天免疫和炎癥反應(yīng)的主要受體，激活后通過髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴性途徑介導炎癥反應(yīng)，導致NF-κB 活化促炎細胞因子（TNF-α、IL-6 等）分泌，與肝內(nèi)脂肪堆積形成脂肪變性導致的肝組織受損共同形成脂肪性肝炎[11-12]。本實驗發(fā)現(xiàn)，高脂血癥模型金黃地鼠在理氣化痰祛瘀方用藥干預后顯著抑制TLR4、TRAF-6 蛋白水平及mRNA 的高表達（P＜0.05），但對下游依賴途徑信號轉(zhuǎn)導通路其他炎性因子IL-1、TGF-B、p40 以及Toll 樣受體相關(guān)分子（TRAM）和由B 干擾素TIF 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）聯(lián)接的非依賴性通路發(fā)揮的影響作用還無法確定。因此，在攝入高脂或高能量飲食后血漿LPS 水平明顯增加后，是否可以通過抑制TLR4 信號通路及其下游信號轉(zhuǎn)導通路元件等相關(guān)促炎因子表達，在治療高脂血癥中發(fā)揮作用的確切機制尚需進一步研究。