錢 祥 陳 卓 張愛(ài)琴#

1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310022

2 中國(guó)科學(xué)院腫瘤與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 浙江 杭州 310022

3 浙江省腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310022

本文研究氣滯血瘀型非小細(xì)胞肺癌腸道菌群與免疫功能的差異，旨在為充實(shí)中醫(yī)理論的現(xiàn)代化研究供應(yīng)新方法，這也將是疾病診斷和健康評(píng)估理念的新起點(diǎn)。

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象：研究對(duì)象為2019年3月1日至2019年10月30日在中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸部外科收治的經(jīng)手術(shù)病理和/或穿刺活檢術(shù)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌且符合本研究組納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，另設(shè)健康人群作為空白對(duì)照組。嚴(yán)格根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)，最終納入氣血瘀滯組13例，健康對(duì)照組12例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)：分述如下。

1.2.1 患者入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～70周歲；參照中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）非小細(xì)胞肺癌診療指南（2018年版），經(jīng)手術(shù)病理和/或穿刺活檢術(shù)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌的患者；非其他部位腫瘤轉(zhuǎn)移至肺部；中醫(yī)辨證分型參照全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材（9版）《中醫(yī)診斷學(xué)》及相關(guān)文獻(xiàn)，辨證結(jié)果符合氣血瘀滯證；患者本人及家屬同意參與本項(xiàng)研究，并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2.2 正常人群入組標(biāo)準(zhǔn)：空白對(duì)照組為正常健康志愿者，年齡18～70周歲，無(wú)合并嚴(yán)重心腦血管類的病史；近期三大常規(guī)、生化指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物、心電圖、超聲、胸部X片等均正常；近期未使用任何抗生素、腸道菌群調(diào)節(jié)劑等藥物；無(wú)吸煙史、酗酒史等不良嗜好；舌質(zhì)淡紅、舌苔薄白，脈象和緩有力。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)：近5年內(nèi)曾患有或合并其他惡性腫瘤，但已充分治療并控制的扁平細(xì)胞癌、子宮頸的原位癌或皮膚基底細(xì)胞癌除外；合并腦血管疾病、心臟病、肝腎相關(guān)疾病等重大內(nèi)科疾病者，或目前正在參與其他臨床實(shí)驗(yàn)的患者；近1月內(nèi)有使用抗生素、腸道菌群調(diào)節(jié)劑等藥物的患者；患有癡呆、精神異常、智力低下等任何妨礙對(duì)知情同意書(shū)理解的患者；不符合氣滯血瘀型中醫(yī)證候辨證分型標(biāo)準(zhǔn)的患者。

1.4 退出標(biāo)準(zhǔn)：依從性差；患者自己要求終止試驗(yàn)；患者不依從臨床研究的相關(guān)程序；中醫(yī)證型發(fā)生改變。

1.5 中醫(yī)辨證：氣滯血瘀證辨證參照全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材（9版）《中醫(yī)診斷學(xué)》及相關(guān)文獻(xiàn)：咳嗽不暢，痛處固定，夜間加劇，拒按，面色紫黯，舌質(zhì)紫黯、邊尖有瘀斑，脈細(xì)澀或結(jié)代。

2 檢測(cè)方法

2.1 試劑與儀器：生化培養(yǎng)箱（LRH-150），酶標(biāo)儀（CMaxPlus），白介素-12（IL-12）試劑盒（MM-2449H1），γ-干擾素（IFN-γ）試劑盒（MM-0033H1），MiSeq Reagent Kit PE300 v3，Roche Light Cycler96，XiangYi H1650-W離心機(jī)，Vortex，NanpDrop，Invitrogen Qubit Spectrophotometer，MiSeq Benchtop Sequencer，DNA電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)，磁力架，瓊脂糖（電泳），TAE（電泳），Aglient SureCycler 8800 Thermal Cycler，80%乙醇（純化），Miseq 2×300v3試劑盒，羅氏LightCycler 96 qPCR儀 ，KaPA library Quantification Kit，含Qiime分析軟件的計(jì)算機(jī)。

2.2 檢測(cè)方法：分述如下。

2.2.1 免疫相關(guān)因子檢測(cè)：使用EDTA抗凝真空采血管收集符合本研究組所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)的患者空腹外周血5ml，靜置半小時(shí)后采用3000r/min離心分離血清，從冰箱中取出血清，室溫復(fù)溫平衡20min，用酶聯(lián)免疫吸附法（PCR）檢測(cè)血清中IL-12、IFN-γ的含量。①標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本：將一定數(shù)目的酶標(biāo)包被板置于框架上，分別設(shè)置空白對(duì)照孔、待測(cè)樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔，并且記錄下三組孔位置，將50μl標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中；將10μl待測(cè)樣本加入待測(cè)樣本孔中，然后再加入40μl樣本稀釋液；空白對(duì)照孔不加。②將100μl辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體分別加入待測(cè)樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔中，空白對(duì)照孔不加。③溫育：反應(yīng)孔用封板膜封住，在37℃的恒溫箱中溫育1h。④洗板：除去液體，并在吸水紙上吸干，將洗滌液填滿每個(gè)孔，靜置1min后將洗滌液除去，繼續(xù)用吸水紙拍干，上述步驟重復(fù)5遍。⑤顯色：每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，用平板混勻器混勻30s，37℃避光顯色15min。⑥終止：拿出酶標(biāo)板，將50μl終止液加入到每個(gè)孔中，終止反應(yīng)。⑦測(cè)定：以空白對(duì)照孔調(diào)零，在終止反應(yīng)后的15min內(nèi)，用450nm的波長(zhǎng)測(cè)量出各孔的吸光值。

2.2.2 腸道菌群檢測(cè)：①糞便采集及DNA提?。号c患者及正常健康志愿者充分溝通后，簽署知情同意書(shū)。采集受試者自然排出至無(wú)菌容器內(nèi)的新鮮糞便，迅速將糞便置于取樣試管中，并1h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品前處理。稱取200mg糞便樣本，然后加入30ml緩沖溶液，置于震蕩器上充分震蕩混勻，高速離心機(jī)以1000rpm離心5min后收集沉淀。重復(fù)上述操作3次后沉淀以10ml緩沖液重懸，將重懸液按每管1ml分裝后放置在－80℃度冰箱中。糞便微生物DNA使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit依照使用說(shuō)明進(jìn)行提取。待提取后，用瓊脂糖凝膠電泳和Thermo Nano Drop 2000紫外微量分光光度計(jì)進(jìn)行總DNA質(zhì)檢。②目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增：將樣本進(jìn)行16S V3-V4區(qū)域擴(kuò)增，引物信息為：Forward primer：CCTACGGGNGGCWGCAG； Reverse primer：GACTACHVGGGTATCTAATCC。將稀釋后的基因組DNA作為模板，使用Phanta Max Master Mix（Vazyme）高保真酶進(jìn)行PCR，以保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確和高效。PCR的反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，重復(fù)25個(gè)循環(huán)；最后72℃持續(xù)5min。PCR反應(yīng)體系為：2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）25μl，引物（10μM）各為2μl，加入ddH2O至50μl。③產(chǎn)物質(zhì)檢：取1.5μlPCR產(chǎn)物（上一步驟所獲取的），使用2%瓊脂糖膠，置于120V電壓下持續(xù)電泳20min后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行紫外成像拍照。④上機(jī)測(cè)序及生信分析：文庫(kù)質(zhì)檢合格后，使用Qubit對(duì)混合文庫(kù)pool進(jìn)行濃度定量，并依據(jù)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)的比例混合，最后運(yùn)行Miseq測(cè)序程序。使用cutadapt軟件將原始數(shù)據(jù)去引物，以確保數(shù)據(jù)是目標(biāo)片段。用pandaseq軟件將不含引物PE（paired-end）序列拼接成長(zhǎng)tags，對(duì)拼接長(zhǎng)tags進(jìn)行質(zhì)控。接著用vsearch軟件對(duì)高質(zhì)量長(zhǎng)序列進(jìn)行去除嵌合體。對(duì)去除嵌合體的高質(zhì)量數(shù)據(jù)按相似度0.97進(jìn)行OTU聚類，挑選代表序列，對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋。同時(shí)使用qiime流程得到OTU豐度表和物種豐度表。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：腸道菌群的數(shù)據(jù)用SPSS 15（SPSS,Chicago,IL,USA）進(jìn)行分析，用秩和檢驗(yàn)方法進(jìn)行組間顯著性差異分析，采用R語(yǔ)言stats包的kruskal.test函數(shù)找出組間有明顯差異(P＜0.05)的物種。免疫部分?jǐn)?shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較，方差齊性者采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

3 研究結(jié)果

3.1 患者基礎(chǔ)資料：13名肺癌患者經(jīng)病理診斷均為腺癌，男性7例，女性6例，平均年齡59.46±7.34歲。參照中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）非小細(xì)胞肺癌診療指南（2018年版）標(biāo)準(zhǔn)，所有患者中I期病例8例（61.5%），Ⅱ期病例5例（38.5%）。

3.2 OTU分析：分述如下。

3.2.1 OTU聚類及稀釋曲線：α多樣性分析是微生態(tài)中常用的方法，用來(lái)評(píng)估測(cè)序深度是否覆蓋全面，反應(yīng)樣品內(nèi)部物種的多樣性，并繪制出相應(yīng)的物種豐富度稀釋曲線圖。詳見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，隨著reads條數(shù)的增加，曲線不斷趨于平坦，說(shuō)明本次使用的數(shù)據(jù)量是比較合理的。

圖1 樣品物種豐富度稀釋曲線圖

3.2.2 OTU韋恩圖分析：16S測(cè)序分析結(jié)果顯示，本研究中25個(gè)樣品共產(chǎn)生了250個(gè)OTU。其中共有OTU 173個(gè)，氣血瘀滯組有33個(gè)獨(dú)有的OTU，健康對(duì)照組有44個(gè)獨(dú)有的OUT，初步說(shuō)明兩組之間OTU具有一定的差異。

圖2 OTU韋恩圖

3.3 差異物種分析：圖3顯示屬水平相對(duì)豐度前20的種系，其中有5個(gè)差異性菌屬，分別是普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Clostridium XIVa）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、放線菌屬（Actinomyces）。

圖3 屬水平差異性菌屬柱狀圖

3.4 血清IL-12和IFN-γ含量變化情況：從表1中可得，與對(duì)照組比較，氣滯血瘀組血清中的IL-12含量顯著降低（P＜0.01），IFN-γ含量降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 血清IL-12和IFN-γ含量變化情況（±s)

表1 血清IL-12和IFN-γ含量變化情況（±s)

注：與對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01。

IFN-γ(pg/ml)715.88±119.29 704.83±87.06組別對(duì)照組氣滯血瘀組IL-12(pg/ml)57.81±5.66 40.20±11.72▲▲

4 分析與討論

本研究發(fā)現(xiàn)普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Clostridium XIVa）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）較健康組顯著富集；放線菌屬（Actinomyces）較健康組顯著降低。組間差異性分析血清IL-12和IFN-γ含量變化情況，發(fā)現(xiàn)與健康組比較，氣滯血瘀組血清中的IL-12含量顯著降低（P＜0.01），IFN-γ含量較健康組低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

中醫(yī)基礎(chǔ)理論與現(xiàn)代微生態(tài)學(xué)有著許多共通之處，腸道微生態(tài)的平衡與失衡實(shí)際上類似于中醫(yī)學(xué)中的正邪理論。從中醫(yī)學(xué)理論來(lái)看，氣滯血瘀屬于邪實(shí)，本研究入組的13名患者皆為早期肺癌，一般情況可，體內(nèi)正氣尚能抗邪，處于邪實(shí)正不虛的狀態(tài)。倘若進(jìn)一步發(fā)展成邪實(shí)正虛甚至一派虛象之地步，腸道微生態(tài)就很可能在其種類、數(shù)目、比例等各個(gè)方面進(jìn)一步發(fā)生改變，宿主的免疫功能也將進(jìn)一步產(chǎn)生變化。此外，在屬水平上，研究結(jié)果提示放線菌屬（Actinomyces）較健康組顯著降低。放線菌屬作為有腸道益生菌，可能直接影響著患者的免疫功能，亦或是其他原因有待證實(shí)。本研究組還檢測(cè)出諸多目前尚未證實(shí)的差異菌屬，即普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Clostridium XIVa）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證如上猜想，亟待總結(jié)并吸取本研究中存在的不足以進(jìn)行后續(xù)更完善的研究。

中醫(yī)藥當(dāng)前面臨著傳承不足、創(chuàng)新不夠的局面，嚴(yán)重制約著自身發(fā)展。中醫(yī)藥發(fā)展離不開(kāi)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的檢測(cè)手段，迫切需要源源不斷地注入創(chuàng)新的“源頭活水”，在更多領(lǐng)域取得新突破。當(dāng)前，免疫組學(xué)、蛋白組學(xué)、腸道微生態(tài)等方面技術(shù)為中醫(yī)藥研究突破提供了有力支撐。本文從氣滯血瘀型非小細(xì)胞肺癌患者腸道菌群與免疫功能的差異入手，并且進(jìn)一步分析探討其深層次原因，推測(cè)肺癌的形成可能是部分腸道菌群通過(guò)調(diào)節(jié)宿主免疫能力的結(jié)果，這是一種行之有效的方法。我們必須秉持“傳承不泥古，創(chuàng)新不離宗”的原則，在傳承中創(chuàng)新，在創(chuàng)新中傳承，推動(dòng)中醫(yī)藥高質(zhì)量發(fā)展。傳承精華，守正創(chuàng)新，必將讓中醫(yī)藥獲得無(wú)限生機(jī)。