劉光財,李鵬昌,李艷艷,任雪巖，王俊寧

(1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.丹東市五道溝林場，遼寧 丹東 118000)

硒是自然界中非常重要的微量元素之一，是動物體內(nèi)和人體健康必需的14種微量元素之一，具有毒性、解毒和營養(yǎng)三重生物學(xué)功效，參與抗氧化、抗癌防癌等多種生理過程，被稱之為生命的保護劑[1-2].人體缺硒與糖尿病、生殖系統(tǒng)疾病、心血管病、癌癥等40多種疾病有關(guān)，是引發(fā)人類大骨節(jié)病、克山病的主要因素[3].Taylor等[4]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國成人每人每天對硒的攝取量僅為26.63 μg/d，遠不足營養(yǎng)協(xié)會的推薦標(biāo)準(zhǔn).植物是無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒和自然界硒循環(huán)生態(tài)鏈中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，又是人類獲取硒的最重要的來源.因此，通過提高硒在植物體內(nèi)的富集含量，生產(chǎn)開發(fā)富硒農(nóng)產(chǎn)品，是改善低硒地區(qū)人們硒營養(yǎng)水平過低的有效途徑之一，對提高人們健康水平具有重要的意義.

豇豆(Vignaunguiculata)是豆科豇豆屬一年生植物.豇豆果實清香可口，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、粗纖維及鈣、硒、銅、鐵、鎂、錳、鋅等礦質(zhì)元素和葉酸、胡蘿卜素、維生素B1、維生素B2、維生素C等多種營養(yǎng)素，況且其生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高，是人們餐桌上常見的蔬菜[5-6].硒也是高等植物的必需微量元素，它能提高油菜、大豆、玉米和小麥等作物的抗氧化能力，增強植物的抗衰老和抗逆性能力，促進植物的正常生長發(fā)育[7].研究表明，適量的硒能促進綠豆芽[8]、黃豆芽[9]、生菜[10]等蔬菜的生長，提高蘋果[11]、甜柿[12]、葡萄[13]等果實的硒含量，同時果實可溶性糖、可溶性蛋白、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)含量顯著增加，果實品質(zhì)得到明顯改善.相關(guān)研究中常見硒處理方法主要有水培施硒、基質(zhì)施硒和葉面施硒，但關(guān)于硒溶液浸種處理對豇豆品質(zhì)及活性氧的研究尚未見報道.本試驗以豇豆為材料，采用不同濃度的亞硒酸鈉溶液處理豇豆種子，研究亞硒酸鈉溶液浸種處理對豇豆品質(zhì)及抗氧化的影響，進而篩選出生產(chǎn)高品質(zhì)豇豆所需的最適亞硒酸鈉溶液濃度，為豇豆品質(zhì)提高提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為美國無架豇豆，采用0、2、4、6、8 mg/L的亞硒酸鈉溶液，在(25±1)℃條件下浸種9 h，期間每隔3 h換1次溶液，將浸種好的豇豆種子播種，豇豆生長期間定期進行澆水、除草、施肥、除蟲等田間管理.在果實掛果約40 d時取樣，并保存于-20 ℃冰箱備用.每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30粒飽滿豇豆種子.

1.2 試驗方法

可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定[14]；維生素C含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測定[15]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[15]；硝酸鹽含量采用水楊酸消化法測定[15]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[16]；超氧陰離子(O2-·)生成速率采用羥胺氧化法測定[17]；過氧化氫(H2O2)含量測定采用過氧化氫測試盒(南京建成生物工程研究所)測定，以每克鮮樣中含有H2O2的毫摩爾來表示(mmol/g)；GSH含量測定采用DTNB法.以上測量方法以鮮質(zhì)量計.

過氧化物酶 (POD)參考Polle等[18]方法，以O(shè)D470分鐘增加0.01定義1個酶活力單位U，以鮮質(zhì)量計，用U/g表示；過氧化氫酶(CAT)參考Torres等[19]方法，OD240每分鐘減少0.01定義1個酶活力單位，以鮮質(zhì)量計，用U/g表示；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性采用Zhu[20]的方法測定，以吸光度每分鐘變化0.1為1個酶活力單位，以鮮質(zhì)量計，用U/g表示；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法[21]測定，以鮮質(zhì)量計，用U/g·h表示.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件進行數(shù)據(jù)整理與分析；用Duncan新復(fù)極差法進行多重差異比較(α=0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉處理對豇豆可溶性蛋白含量的影響

如圖1所示，亞硒酸鈉浸種可以極顯著地提高豇豆果實可溶性蛋白質(zhì)含量(P<0.01)，且隨著亞硒酸鈉濃度的升高，其含量呈先上升后下降的變化趨勢，可能是硒在一定程度上參與蛋白質(zhì)合成；其中4 mg/L亞硒酸鈉的處理可溶性蛋白含量最高，為(1.41±0.02) mg/g，比CK高38%.2、6、8 mg/L亞硒酸鈉處理的可溶性蛋白質(zhì)含量分別較CK高28%、17%、8%，且各濃度之間差異極顯著(P<0.01).

圖1 亞硒酸鈉對蛋白質(zhì)含量的影響Figure 1 Effect of sodium selenite on soluble protein content

2.2 亞硒酸鈉處理對豇豆維生素C含量的影響

亞硒酸鈉浸種極顯著地提高了豇豆果實維生素C含量(P<0.01)，且隨濃度的增大呈先上升后下降的變化趨勢，可能是由于植株中硒蛋白含量升高，減輕對VC的氧化，其中4 mg/L亞硒酸鈉處理含量最高為(31.65±0.56)mg/100 g，比CK高出28%，其次是4、2 mg/L亞硒酸鈉處理組，分別比CK高出20%和17%(圖2).除2、6 mg/L亞硒酸鈉處理之間無差異外，其他濃度間差異極顯著(P<0.01).可見，適量濃度的亞硒酸鈉(≤4 mg/L)有利于豇豆果實維生素C的積累，高濃度反而不利于維生素C的合成.

圖2 亞硒酸鈉對維生素C含量的影響Figure 2 Effect of sodium selenite on VC content

2.3 亞硒酸鈉處理對豇豆可溶性總糖含量的影響

如圖3所示，2、4、6、8 mg/L亞硒酸鈉處理均極顯著提高了豇豆可溶性總糖含量(P<0.01)，分別比CK提高了28%、47%、25%和16%，這可能是亞硒酸鈉能夠增加土壤中有效氮含量，提高了植株光合效率，其中4 mg/L亞硒酸鈉含量最高，為(80.98±1.19) μg/g.2、6 mg/L亞硒酸鈉之間無差異，其他濃度間差異極顯著(P<0.01).

圖3 亞硒酸鈉對可溶性糖含量的影響Figure 3 Effect of sodium selenite on soluble sugar content

2.4 亞硒酸鈉處理對豇豆硝酸鹽含量的影響

由圖4可知，未處理的豇豆硝酸鹽含量最高為(393.14±6.28) μg/g，亞硒酸鈉處理極顯著地降低了硝酸鹽含量(P<0.01)，但隨著亞硒酸鈉濃度的升高，硝酸鹽含量先降后升，其中6 mg/L亞硒酸鈉處理的含量最低，為(310.88±2.90)μg/g，比對照降低了21%，而2、4、8 mg/L亞硒酸鈉處理分別比CK降低了9%、16%和12%.此外，各濃度之間差異極顯著(P<0.01).可見，低濃度的亞硒酸鈉對豇豆果實硝酸鹽的積累有抑制作用，但濃度過高，抑制效果有所下降，這可能與亞硒酸鈉影響土壤中NO3--N/NH4+-N有關(guān).

圖4 亞硒酸鈉對硝酸鹽含量的影響Figure 4 Effect of sodium selenite on nitrate content

2.5 亞硒酸鈉處理對豇豆MDA含量的影響

CK的MDA含量為(6.52±0.06) μmol/g，亞硒酸鈉處理極顯著降低了豇豆果實的MDA含量(P<0.01)，且隨著濃度的增加，MDA含量呈先降后升的變化，其中6 mg/L亞硒酸鈉含量最低為(4.81±0.03) μmol/g，比CK降低了26%，而2、4、8 mg/L亞硒酸鈉分別比CK降低了9%、13%和15%(圖5).4、8 mg/L亞硒酸鈉之間無差異，其他濃度間差異極顯著(P<0.01).6 mg/L亞硒酸鈉處理濃度能最大程度地降低豇豆的MDA含量.

圖5 亞硒酸鈉對MDA含量的影響Figure 5 Effect of sodium selenite on MDA content

2.6 亞硒酸鈉處理對豇豆O2-·生成速率的影響

由圖6可知，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，豇豆O2-·的生成速率先降后升，其中6 mg/L亞硒酸鈉的含量最小，為(6.45±0.15) μg/g.顯著性分析表明，2、4、6、8 mg/L亞硒酸鈉處理的O2-·生成速率量均極顯著低于CK(P<0.01)，分別比CK下降了12%、21%、28%和22%.各濃度處理間差異達到極顯著水平(P<0.01).亞硒酸鈉有效地抑制了O2-·的生成.

圖6 亞硒酸鈉對O2-·生成速率的影響Figure 6 Effect of sodium selenite on O2-· production rate

2.7 亞硒酸鈉處理對豇豆H2O2含量的影響

亞硒酸鈉處理極顯著降低了豇豆果實的H2O2含量(P<0.01)，其效果隨亞硒酸鈉濃度的增加呈先降后升的變化，為亞硒酸鈉濃度為6 mg/L時的H2O2含量最低，為(9.36±0.36) mmol/g，比CK下降了36%，而2、4、8 mg/L分別比CK下降了12%、24%和20%(圖7).4、8 mg/L亞硒酸鈉的H2O2含量無差異，其他濃度間差異極顯著(P<0.01).這說明亞硒酸鈉能有效抑制H2O2的生成，延緩細胞的衰老，最佳濃度為6 mg/L.

圖7 亞硒酸鈉對H2O2含量的影響Figure 7 Effect of sodium selenite on H2O2 content

2.8 亞硒酸鈉處理對豇豆GSH含量的影響

如圖8所示，亞硒酸鈉處理極顯著提高了豇豆果實GSH含量(P<0.01)，且隨著濃度的升高其含量呈先升后降的趨勢，其中6 mg/L亞硒酸鈉的GSH含量最高，為(77.44±1.37) μg/g，比CK高76%，CK僅為(44.00±1.30) μg/g，2、4、8 mg/L分別比CK高出36%、55%和60%.4和8 mg/L亞硒酸鈉的GSH含量無差異，其他濃度間差異極顯著(P<0.01).可見，6 mg/L亞硒酸鈉處理的豇豆GSH含量更高，抗氧化性更好，能更有效延緩細胞的衰老.

圖8 亞硒酸鈉對GSH含量的影響Figure 8 Effect of sodium selenite on GSH content

2.9 亞硒酸鈉處理對豇豆抗APX活性的影響

由圖9可知，亞硒酸鈉處理極顯著提高了豇豆APX活性(P<0.01)，且隨濃度的升高而呈先升后降的變化趨勢，其中6 mg/L亞硒酸鈉的APX活性最高，為(77.27±3.49) U/g，較CK高出112%，而2、4、8 mg/L亞硒酸鈉分別比CK高出52%、81%和82%.4、8 mg/L亞硒酸鈉的APX活性無差異，其他濃度間差異極顯著(P<0.01).可見，亞硒酸鈉處理大幅度提高了豇豆APX活性，其中6 mg/L濃度最好.

圖9 亞硒酸鈉對APX活性的影響Figure 9 Effect of sodium selenite on APX activities

2.10 亞硒酸鈉處理對豇豆POD活性的影響

如圖10所示，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，豇豆POD活性先升后降，濃度為6 mg/L時POD活性最大，為(174.09±5.51) U/g.2、4、6、8 mg/L亞硒酸鈉處理均極顯著地提高了豇豆POD活性(P<0.01)，分別比CK提高了15%、22%、40%和24%.4、8 mg/L亞硒酸鈉的POD活性無差異，其他濃度間差異達到顯著或極顯著.可見，6 mg/L亞硒酸鈉能最有效地提高豇豆POD活性，利于H2O2清除.

圖10 亞硒酸鈉對POD活性的影響Figure 10 Effect of sodium selenite on POD activities

2.11 亞硒酸鈉處理對豇豆CAT活性的影響

由圖11可知，亞硒酸鈉對豇豆CAT活性的影響也隨濃度的升高先升后降，其中6 mg/L亞硒酸鈉的活性最高，為(110.30±1.04) U/g.2、4、6、8 mg/L亞硒酸鈉處理的CAT活性極顯著高于CK(P<0.01)，分別比CK高出13%、26%、37%和28%.4、8 mg/L亞硒酸鈉的CAT活性無差異，其他濃度間差異達到顯著或極顯著.這說明，適量的亞硒酸鈉能提高豇豆CAT活性，其中6 mg/L的效果最佳.

圖11 亞硒酸鈉對CAT活性的影響Figure 11 Effect of sodium selenite on CAT activities

2.12 亞硒酸鈉處理對豇豆SOD活性的影響

如圖12所示，亞硒酸鈉處理極顯著提高了豇豆SOD活性(P<0.01)，且隨著濃度的增加而提高.2、4、6、8 mg/L亞硒酸鈉處理的SOD活性分別比CK提高了35%、56%、68%和95%，其中8 mg/L亞硒酸鈉處理效果最好，為(207.81±3.15) U/g·h.各濃度之間差異極顯著(P<0.01).

3 討論

硒是高等植物的必需微量元素，能促進植物的正常生長發(fā)育，并提高作物的品質(zhì)和產(chǎn)量[7-9].周大寨等[22]和高學(xué)云等[23]研究表明，適量的亞硒酸鈉可提高煙葉和花椰菜中的可溶性蛋白質(zhì)含量.贛南臍橙[24]和大蒜[25]用外源硒處理促進了維生素C的合成，落葵[26]和大蒜[27]用一定濃度的硒處理增加了它們的可溶性糖含量，降低了大蒜生長期間蒜苗葉片和假莖中的硝酸鹽含量.谷云等[28]還發(fā)現(xiàn)，硒還可以顯著降低蔬菜發(fā)酵過程中的硝酸鹽含量.本研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的亞硒酸鈉處理，能有效提高豇豆果實中可溶性蛋白質(zhì)和維生素C含量，這應(yīng)該是Na2SeO3被植物吸收轉(zhuǎn)化為有機硒，參與蛋白質(zhì)合成[29]，提高硒蛋白含量，從而減輕細胞中過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物對VC的氧化[30-31]；可溶性總糖含量上升，均達到極顯著水平(P<0.01)，并能極顯著降低豇豆的硝酸鹽含量(P<0.01)，可能是因為Na2SeO3對土壤酶活性、有效氮含量有影響，提高了光合速率，改善了土壤NO3--N/NH4+-N，這與上述研究者的結(jié)果一致[22-28].

圖12 亞硒酸鈉對SOD活性的影響Figure 12 Effect of sodium selenite on SOD activities

O2-·和H2O2是植物膜脂過氧化過程中常見的自由基，MDA則是細胞膜膜脂過氧化作用的終產(chǎn)物之一.趙耀等[32]在麥苗、余日安等[33]在大鼠肝臟上研究表明，在一定范圍內(nèi)，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，麥苗清除羥自由基和超氧陰離子自由基的活力也逐漸增加，同時也抑制了自由基生成；但高劑量的亞硒酸鈉，則會增加肝臟中自由基的生成，氧化應(yīng)激明顯.段碧輝等[34]發(fā)現(xiàn)適宜濃度的硒處理可以促進缺硼脅迫下苗期油菜的生長，顯著提高油菜幼苗葉片的抗氧化酶活性，并顯著降低H2O2含量.此外，適量的補硒可以明顯降低紫球藻細胞[35]和油菜苗[36]的MDA含量，但濃度過高反而會促進MDA的生成.本試驗結(jié)果顯示，亞硒酸鈉浸種處理極顯著地抑制了豇豆果實中超氧陰離子的生成速率和降低了H2O2含量的積累(P<0.01)，減少了自由基的產(chǎn)生，緩解了細胞膜膜脂過氧化作用，有效地降低豇豆中的MDA含量，其中6 mg/L亞硒酸鈉處理效果最好，這與前人的研究相符[32-36].

SOD、POD、CAT、APX等酶和GSH等小分子還原性物質(zhì)是植物體內(nèi)活性氧清除主要系統(tǒng).趙耀等[37]研究發(fā)現(xiàn)，用亞硒酸鈉處理小麥的幼苗和種子，能增加麥苗的GSH含量.凌棗用硒處理能顯著提高果實SOD活性，并顯著改善了果實的品質(zhì)[38].武蕓等[39]發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的硒處理促進了荸薺組培苗的生長，提高了SOD、POD活性，但濃度過高對SOD活性和組培苗的生長反而有抑制作用.此外還發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的硒處理，增加了水稻幼苗葉片[40]POD活性，提高了平菇菌絲體[41]和梨葉片[42]內(nèi)的CAT活性，顯著地提高了梨葉片[42]和低溫脅迫下鐵皮石斛幼苗[43]中的APX活性，但濃度過高或過低會抑制水稻幼苗增高和增重，并降低CAT活性.本研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉浸種處理能極顯著提高豇豆果實中的GSH含量，2～6 mg/L亞硒酸鈉處理極顯著地提高豇豆果實中SOD、POD、CAT和APX酶活性(P<0.01)，但濃度過高(8 mg/L)，POD、CAT和APX酶活性反而有所下降(見圖9-12)，這與前人[37-43]等的研究結(jié)果相吻合.不同的是，高濃度的亞硒酸鈉處理(8 mg/L)對SOD活性的增加并無抑制作用，可能是不同的物種，SOD活性對硒濃度的耐受力不同所致.

綜上所述，適當(dāng)濃度亞硒酸鈉溶液浸種處理可能能夠改良植株根系微環(huán)境，從而提高豇豆品質(zhì)，且硒參與合成谷胱甘肽過氧化物酶，通過調(diào)節(jié)植物內(nèi)環(huán)境離子平衡，來提高各類抗氧化酶活性.

4 結(jié)論

本研究中，4 mg/L亞硒酸鈉溶液浸種處理，豇豆可溶性蛋白、維生素C和可溶性糖含量最高，品質(zhì)最好；6 mg/L亞硒酸鈉處理，硝酸鹽、自由基、氧化類物質(zhì)含量最低，各類抗氧化酶活性最高，抗氧化能力最強.