鱘源嗜麥芽窄食單胞菌的分離鑒定及藥敏特性分析

商寶娣，陶 莎，楊 星，李小義，李正友，張效平，孔 杰

( 1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025 )

鱘形目魚類是現(xiàn)存世界上最古老的魚類之一，具有“活化石”之稱。鱘魚因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，具有較高的食用價值，同時也具有一定的藥用價值。特別是用其卵加工而成的魚子醬，更是馳名中外的高檔食品，素有“黑色黃金”之稱。因鱘具有易馴養(yǎng)、生長快及個體大等特點，自1992年我國第一個鱘規(guī)?；B(yǎng)殖場成立以來，經(jīng)過20多年的發(fā)展，我國成為世界第一大鱘魚養(yǎng)殖國。貴州省地處云貴高原，冷水資源非常豐富，包括地下溶洞水、溪流水、水庫底層水等，適宜開展鱘魚等冷水性魚類的養(yǎng)殖。自1999年貴州省水產(chǎn)研究所引進鱘魚進行養(yǎng)殖后，經(jīng)過20年的發(fā)展，目前貴州省各個地州市都將鱘魚養(yǎng)殖作為重點工作來推廣，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量不斷提高，經(jīng)濟效益和社會效益十分顯著[1]。其中雜交鱘[達氏鰉(Husodauricus)♀×史氏鱘(Acipenserschrenckii)♂]是貴州省最重要的冷水魚養(yǎng)殖種類。

在鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)?；?、設(shè)施化不斷提高的同時，鱘魚病害的暴發(fā)也越來越頻繁和嚴重，造成重大經(jīng)濟損失，嚴重影響了鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。細菌病則是其中最重要的病害。目前已經(jīng)報道的鱘致病菌主要有惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[2]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[3]、維氏氣單胞菌(A.veronii)[4]、類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)[5]、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[6,7]、產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)[8]、魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)[9-10]、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[11]、瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)[12]、分枝桿菌(Mycobacterium)[13]、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)[14]等。在貴州地區(qū)，因疾病造成的鱘魚死亡事件也越來越多，解決這一問題的關(guān)鍵是對造成死亡的疾病進行有效鑒定及提出有效防控手段[15]。

2017年9—10月，在貴州省綏陽縣某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的雜交鱘陸續(xù)出現(xiàn)死亡，持續(xù)時間長達1月余，發(fā)病死亡魚體質(zhì)量為0.5～2.0 kg，發(fā)病水溫為22～25 ℃，累計死亡約20%。筆者選取發(fā)病雜交鱘的肝臟進行病原菌分離，通過培養(yǎng)獲得1株優(yōu)勢細菌，對優(yōu)勢菌進行人工回歸感染來驗證這株菌的致病性，結(jié)合細菌的形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列及gyrB序列等數(shù)據(jù)對菌種類型進行準確鑒定，并通過K-B法測試了其對常用抗生素的敏感性，為生產(chǎn)實踐中此病的有效防治提供科學(xué)指導(dǎo)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

具有典型癥狀的雜交鱘取自貴州省綏陽縣某養(yǎng)殖場，體質(zhì)量(1.2±0.6) kg，用于病原菌分離。人工回歸感染試驗所用雜交鱘購于貴州省水產(chǎn)研究所惠水試驗基地，規(guī)格統(tǒng)一、體型體色正常、活力較好，平均體質(zhì)量(1.5±0.2) kg，試驗前22 ℃水溫暫養(yǎng)7 d。

主要試劑：普通營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯、水解酪蛋白瓊脂、革蘭氏染色液、細菌微量生化鑒定管及藥敏試紙(杭州微生物試劑有限公司)；DNA聚合酶、細菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；PCR所用特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

主要儀器：正置顯微鏡、凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白檢測儀、PCR基因擴增儀、生化培養(yǎng)箱、全自動高壓滅菌鍋、電子天平等。

1.2 現(xiàn)場診斷

及時走訪現(xiàn)場調(diào)研，了解病害發(fā)生情況；現(xiàn)場觀察病魚的體型體色、攝食情況、行為特點等。選擇具有典型特征的瀕死雜交鱘進行現(xiàn)場檢查，按照先體表后體內(nèi)的順序，先檢查病魚頭部、鰓、鰭條、體表等部位，記錄破損、出血、潰瘍等病變情況及有無寄生蟲等寄生，觀察腹部腫大及肛門紅腫情況；解剖后觀察肌肉、肝、腎、膽囊、鰾、腸等組織器官的病變反應(yīng)。

1.3 實驗室診斷

1.3.1 病原菌分離

取瀕死并具有典型癥狀的病魚，超凈工作臺中取肝組織劃線于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后挑取平板上形態(tài)、規(guī)格及顏色等特征基本一致的菌落再次劃線于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)，此次共分離獲得純培養(yǎng)菌株1株，編號為SXG-1。將SXG-1菌株于胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h后，與50%甘油混合均勻，于超低溫冰箱-80 ℃保存待用。

1.3.2 人工回歸感染試驗

將分離株SXG-1接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，置于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，按照試驗要求參照麥氏比濁法將菌懸液密度分別調(diào)整為5.0×1010、5.0×109、5.0×108、5.0×107、5.0×106cfu/mL。取暫養(yǎng)7 d的感染用雜交鱘，分為5個試驗組及1個對照組，每組設(shè)置3個平行，每個平行放置10尾雜交鱘。采用腹腔注射法對健康雜交鱘進行人工感染，試驗組每尾雜交鱘注射SXG-1菌懸液0.2 mL，對照組注射同等量滅菌磷酸緩沖鹽溶液。試驗期間保持充足溶解氧及22 ℃恒定水溫。自注射后每24 h觀察一次，記錄雜交鱘的行為狀況和死亡數(shù)量。對剛死亡及瀕臨死亡的病魚進行解剖，觀察病變情況，同時進行細菌再分離鑒定。人工感染試驗周期為10 d。通過SPSS 21.0計算半數(shù)致死密度(LC50)。

1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

將SXG-1菌株接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)、規(guī)格、顏色等特征。將菌株進行革蘭氏染色，觀察菌落特征。

利用細菌微量生化鑒定管參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]中的方法，對菌株SXG-1的各項生化指標進行測定。

1.3.4 16S rDNA、gyrB基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將SXG-1菌株接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后收集菌體。利用細菌DNA提取試劑盒提取病原菌DNA。以提取的病原菌DNA為模板，分別使用細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)、gyrB通用引物3F(5′-TCGGGCGGCCTGCACGGCGTCGGCGTCAG-3′)和14R(5′-TTGTCCGGGTTGTACT-CGTC-3′)進行PCR擴增。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化DNA擴增產(chǎn)物，將回收后的片段克隆到PMD18-T載體上(Takara)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒后由生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

將測序獲得的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析，從中選取同源性較高的菌株序列采用Clustal X 1.83軟件進行多重比對分析，通過MEGA 4 軟件中的鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1000次Bootstrap檢驗各分支的置信度。

1.3.5 藥物敏感試驗

采取紙片擴散法(K-B法)對45種抗生素的敏感性進行測定。將菌株SXG-1的菌液密度調(diào)整為5.0×106cfu/mL，并取150 μL均勻涂布于MH瓊脂平板，然后將45種抗生素藥敏紙片分別貼于MH瓊脂平板上，每個平板貼5片。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，分別測量各種抗生素抑菌圈直徑大小(mm)，根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片抑菌圈標準判定致病菌株對藥物的敏感程度。

2 結(jié) 果

2.1 患病雜交鱘臨床表現(xiàn)及宏觀病理變化

病魚行動遲緩，體色發(fā)黑，攝食下降甚至不攝食，腹部有出血點，鰭條出血，肛門紅腫；解剖后發(fā)現(xiàn)有少量腹水，肝臟充血出血，質(zhì)地不易碎；腸道內(nèi)有少量食物，充血，內(nèi)有透明液體；腎臟顏色變淺。發(fā)病持續(xù)時間為1月余，累計死亡率達20%。

2.2 人工回歸感染試驗

人工回歸感染試驗累積死亡率結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，雜交鱘在注射5.0×1010、5.0×109、5.0×108cfu/mL菌懸液均在感染第2 d開始出現(xiàn)死亡，接下來的4 d雜交鱘死亡數(shù)量較多；5.0×107、5.0×106cfu/mL 2個試驗組均是在第4 d開始出現(xiàn)死亡；5個試驗組的累計死亡率均隨著攻毒時間的延長而增加。由表1可見，注射菌液密度達到5.0×108cfu/mL時，累積死亡率為50.0%，當(dāng)密度為5.0×1010cfu/mL時，雜交鱘在第7 d的死亡率已達到100%。對照組雜交鱘在試驗期間未出現(xiàn)死亡。經(jīng)SPSS 21.0軟件計算，菌株SXG-1的半數(shù)致死密度為3.9×108cfu/mL。

表1 菌株SXG-1的人工感染試驗結(jié)果

圖1 SXG-1人工感染雜交鱘的累積死亡率與感染時間關(guān)系曲線

人工感染菌株SXG-1后，瀕死雜交鱘的主要癥狀與自然發(fā)病癥狀基本一致。從人工感染發(fā)病的雜交鱘中分離到的菌株與SXG-1特征一致，綜上，菌株SXG-1為此次患病雜交鱘的致病菌。

2.3 病原菌形態(tài)及生理生化特征

菌株SXG-1在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h，形成圓形、淡黃色、半透明菌落，菌落表面濕潤，中央隆起，邊緣整齊；在綿羊血平板培養(yǎng)基上不溶血，產(chǎn)淡綠色色素。經(jīng)革蘭氏染色，1000倍油鏡下鏡檢，結(jié)果顯示，菌株SXG-1為革蘭氏陰性菌，短桿棒狀，兩端鈍圓。

菌株SXG-1的主要生理生化特征為O/F試驗為氧化產(chǎn)酸，克氏雙糖鐵反應(yīng)同非發(fā)酵菌，氧化酶陰性，泰能耐藥，動力陽性(取蛋白胨水觀察)，七葉苷、DNA酶、賴氨酸脫羧酶、液化明膠陽性(表2)。根據(jù)該菌的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性初步鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，但由于其在糖的利用上與嗜麥芽窄食單胞菌模式株存在差異(表2)，故結(jié)合16S rDNA和gyrB持家基因序列分析進行準確鑒定。

表2 SXG-1的生理生化特征

2.4 16S rDNA、gyrB基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測序獲得的菌株SXG-1 16S rDNA基因序列全長1506 bp(登錄號:MN709089)，在GenBank 中進行Blast同源性比對，結(jié)果顯示，所測序列與嗜麥芽窄食單胞菌MTCC 434T(登錄號：JALV01000036) 16S rDNA核苷酸序列同源性最高，為99.66%；與StenotrophomonaspavaniiDSM 25135T (登錄號：LDJN01000038)和PseudomonasgeniculataATCC 19374T (登錄號：AB021404)16S rDNA核苷酸序列同源性分別為99.59%和99.44%。選擇20個同源性較高的細菌16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)果顯示，菌株SXG-1與嗜麥芽窄食單胞菌聚為一個分支。

圖2 SXG-1基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

測序獲得的菌株SXG-1 gyrB基因序列全長1130 bp(登錄號：MN709090)，在GenBank 中進行Blast同源性比對，結(jié)果顯示，所測序列與嗜麥芽窄食單胞菌ISMMS2(登錄號：CP011305.1)，嗜麥芽窄食單胞菌ISMMS2R(登錄號：CP011306.1)gyrB基因核苷酸序列同源性最高，為99.82%。挑選相似度90%以上的多個不同菌株基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示，菌株SXG-1與嗜麥芽窄食單胞菌聚為一個分支。因此，綜合常規(guī)生理生化和16S rDNA、gyrB基因序列分析結(jié)果表明，菌株SXG-1為嗜麥芽窄食單胞菌。

圖3 SXG-1基于gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.5 藥敏試驗

通過K-B法對45種供試抗生素藥物敏感性進行了研究，結(jié)果表明，嗜麥芽窄食單胞菌SXG-1對氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星4種藥物敏感，對阿奇霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、多黏菌素B、氯霉素5種藥物中度敏感，對其他36種藥物耐藥(表3)。

表3 嗜麥芽窄食單胞菌SXG-1的藥敏試驗結(jié)果

(續(xù)表3)

3 討 論

3.1 嗜麥芽窄食單胞菌的分離鑒定

1943年首次從人類胸腔積液中分離獲得該菌，命名為布魯克桿菌(Bacteriumbookeri)；1961年該菌重新被命名為嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)；1983年更名為嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonasmaltophilia)；1993年改為現(xiàn)名，即嗜麥芽窄食單胞菌[13]。

嗜麥芽窄食單胞菌廣泛存在于土壤、水、植物、動物和食物等自然界中，在醫(yī)院環(huán)境中也普遍存在，是一種人類重要的條件致病菌和醫(yī)院感染的重要病原菌，可引起人類的呼吸道感染、敗血癥、肺炎、結(jié)膜炎、腦炎等，在人類醫(yī)學(xué)上已引起高度重視[18]。除了對人類具有致病作用以外，還對山羊[19]和豬[20]等陸生哺乳動物具有致病性。魚類等水生動物也是其重要的天然貯存宿主，國內(nèi)外學(xué)者相繼自錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)[21]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[22]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[23]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[24]等宿主體內(nèi)分離到該菌，同時也有報道指出該菌也對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[25]、黃緣閉殼龜(Cistoclemmysflavomarginata)[26]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[27]、斑點叉尾(Ictalunespunctatus)[28]、黃喉擬水龜(Mauremysmutica)[29]和齊爾白鮭(Coregonusnasus)[30]等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物造成嚴重經(jīng)濟損失。本試驗首次自患病雜交鱘體內(nèi)分離到致病菌株SXG-1，通過革蘭氏染色、細菌微量生化鑒定管等對細菌的形態(tài)學(xué)、生理生化特性進行了研究，結(jié)果表明，菌株SXG-1的特征與單胞菌屬一致；16S rDNA基因序列進化樹分析結(jié)果表明，雖然該菌與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌聚為一支，但與S.pavaniiDSM 25135T和P.geniculataATCC 19374T 16S rDNA核苷酸序列同源性也很高。促旋酶B亞單位基因(gyrB基因)全長約1.2～1.4 kb，以單拷貝形式普遍存在于細菌基因組上，其進化率和變異率均高于16S rDNA[31]。目前gyrB基因在菌種鑒定及系統(tǒng)進化分析方面得到了廣泛應(yīng)用。結(jié)合16S rDNA序列、gyrB序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，準確確定分離病原菌為嗜麥芽窄食單胞菌。

此次感染嗜麥芽窄食單胞菌未造成雜交鱘暴發(fā)性大規(guī)模死亡，發(fā)病癥狀與死亡情況與感染齊爾白鮭[30]癥狀相似，與感染卵形鯧鲹[25]和斑點叉尾[28]引起的急性流行性大規(guī)模死亡不同。雜交鱘和齊爾白鮭都屬于冷水性魚類，是否為嗜麥芽窄食單胞菌引起的冷水性魚類發(fā)病出現(xiàn)相同癥狀有待進一步證實。嗜麥芽窄食單胞菌作為致病菌感染雜交鱘在國內(nèi)尚屬首次報道，表明嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的感染范圍在擴大，其危害性進一步增強，需引起冷水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重視。

3.2 藥物敏感試驗

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素的使用仍是防控細菌病最常用、最有效的方法。嗜麥芽窄食單胞菌是一種具有多重耐藥性的細菌，耐藥機制復(fù)雜，目前已知對β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和碳青霉烯類具有很強的耐藥性[32]。本試驗測定了嗜麥芽窄食單胞菌SXG-1對45種抗生素藥物的敏感性，結(jié)果表明，該菌具有很強的耐藥性，僅對氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星4種藥物敏感，對阿莫西林、哌拉西林、克拉霉素、妥布霉素、慶大霉素等36種藥物耐藥。本次藥敏結(jié)果與周永燦等[25]的試驗結(jié)果有些不同，可能是由于地域、環(huán)境和宿主不同等因素引起，也可能是由于分離株不同的藥物接觸史或耐藥基因間的傳播造成的，菌株間耐藥性的差異給細菌病的治療帶來極大困難。而在4種敏感藥物中，只有恩諾沙星和氟苯尼考可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控中，具體的有效含量、使用方式等還需要進一步研究。本次試驗結(jié)果對于指導(dǎo)該病的藥物防控具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性測定與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，首次從患病雜交鱘體內(nèi)分離到致病菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SXG-1。通過藥物敏感試驗，初步篩選出恩諾沙星和氟苯尼考可用于鱘魚此病的防控。