葛永春,吳旭干
( 1.上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201306; 2.上海登瀛水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社,上海 202164; 3.上海海洋大學(xué),水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 201306; 4.上海海洋大學(xué),水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306 )
中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國(guó)最重要的養(yǎng)殖蟹類,2017年全國(guó)成蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量為7.509×105t[1],產(chǎn)值500多億元。性腺作為中華絨螯蟹的主要可食部位之一,其發(fā)育的優(yōu)劣直接關(guān)系到中華絨螯蟹的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。由于雌蟹的性腺指數(shù)遠(yuǎn)高于雄蟹,且雌蟹性腺(卵巢)中富含n-3高度不飽和脂肪酸、必需氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此卵巢發(fā)育良好的雌蟹(紅膏蟹)市場(chǎng)價(jià)格較高[2-4]。此外,我國(guó)中華絨螯蟹養(yǎng)殖苗種主要依靠挑選池塘養(yǎng)殖親本進(jìn)行人工繁殖,所以中華絨螯蟹的卵巢發(fā)育情況直接關(guān)系到后續(xù)的交配繁殖[4-5]。
生殖蛻殼是短尾派蟹類自亞成體向成體過(guò)渡的一次關(guān)鍵蛻殼,中華絨螯蟹卵巢通常在生殖蛻殼后快速發(fā)育[3,6-7]。但是,蟹類蛻殼期間及剛蛻殼后非常脆弱,極易遭受敵害生物和同類的侵襲而死亡[8]。此外,池塘養(yǎng)殖過(guò)程中通常在中華絨螯蟹卵巢發(fā)育的后期投喂優(yōu)質(zhì)餌料進(jìn)行育肥,以促進(jìn)卵巢發(fā)育和提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2,9]。因此查明中華絨螯蟹生殖蛻殼后的成活率和卵巢發(fā)育規(guī)律不僅對(duì)其在實(shí)際生產(chǎn)中的養(yǎng)殖管理有一定的現(xiàn)實(shí)意義,而且可以為學(xué)者們?cè)诳蒲泄ぷ髦羞x擇不同卵巢發(fā)育階段的中華絨螯蟹雌體提供一定的基礎(chǔ)資料。鑒于此,筆者以生殖蛻殼前雌蟹為對(duì)象,研究其在群體養(yǎng)殖條件下生殖蛻殼后的成活率、質(zhì)量增加率和卵巢發(fā)育規(guī)律的變化,以進(jìn)一步為中華絨螯蟹養(yǎng)殖管理、育肥和捕撈上市等提供基礎(chǔ)資料和實(shí)踐依據(jù)。
試驗(yàn)蟹于2018年8月初取自上海崇明東風(fēng)試驗(yàn)基地的室外養(yǎng)殖池塘。試驗(yàn)初期選取肢體健全、活力好且均處于生殖蛻殼前的雌蟹80只,體質(zhì)量為50~70 g,放入室內(nèi)2.5 m×3.75 m×1.0 m聚乙烯水桶中,暫養(yǎng)一周后開(kāi)始正式試驗(yàn)。
試驗(yàn)共設(shè)計(jì)3個(gè)水桶,每個(gè)水桶內(nèi)隨機(jī)放入15只中華絨螯蟹,3個(gè)水桶隨機(jī)標(biāo)記為1#、2#、3#,并對(duì)每個(gè)桶內(nèi)的中華絨螯蟹進(jìn)行稱量質(zhì)量和標(biāo)記,用油漆筆在蟹殼上標(biāo)記為1#-1~1#-15,以此類推,以便于后續(xù)的觀察。試驗(yàn)過(guò)程中,每日檢查和記錄死亡個(gè)體的數(shù)量、完成生殖蛻殼個(gè)體的數(shù)量和蛻殼時(shí)間。當(dāng)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹生殖蛻殼后的殼硬化后,取出稱量質(zhì)量并記錄。為研究中華絨螯蟹生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育規(guī)律,取生殖蛻殼后的30只雌體繼續(xù)養(yǎng)殖60 d,每5~10 d解剖1次。具體的采樣時(shí)間為6次:雌蟹生殖蛻殼后1~10 d、11~20 d、21~30 d、31~40 d、41~50 d、51~60 d。每個(gè)采樣時(shí)間均隨機(jī)解剖3只,記錄其卵巢質(zhì)量和體質(zhì)量,同時(shí)取少量卵巢組織固定于波恩氏液中,以研究其生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育情況。試驗(yàn)期間,每個(gè)養(yǎng)殖水桶中均放有聚氯乙烯板和水草等遮蔽物供蟹隱藏。
試驗(yàn)期間,每日18:00投喂配合飼料,投喂量為蟹體質(zhì)量的1%~3%,次日8:00清除殘餌和糞便,并根據(jù)殘餌、水溫和攝食情況適當(dāng)調(diào)整投餌量。每隔8 h觀察并記錄中華絨螯蟹蛻殼和死亡情況,以便于統(tǒng)計(jì)蛻殼時(shí)間和成活率。一旦發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹蛻殼,立即將其放入單養(yǎng)塑料盒中,待蟹殼硬化后再用記號(hào)筆標(biāo)注放入原先的養(yǎng)殖水槽中繼續(xù)養(yǎng)殖。采用循環(huán)水工藝對(duì)養(yǎng)殖用水進(jìn)行凈化處理,定期采用曝氣后的自來(lái)水來(lái)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分。試驗(yàn)期間,24 h連續(xù)充氧,自然光照,試驗(yàn)期間自然水溫19.2~28.5 ℃。養(yǎng)殖水體pH 7.0~8.5,溶解氧>4 mg/L,氨氮<0.5 mg/L,亞硝態(tài)氮<0.15 mg/L。
1.3.1 質(zhì)量增加率和死亡率
試驗(yàn)過(guò)程中,每日檢查和記錄完成生殖蛻殼和死亡個(gè)體的數(shù)量,當(dāng)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹生殖蛻殼后的殼硬化后取出稱量質(zhì)量,稱量前用干毛巾拭去體表水分,電子天平稱量(精確至0.01 g),測(cè)量完成后放回原處繼續(xù)養(yǎng)殖。根據(jù)下式計(jì)算生殖蛻殼后的成活率和質(zhì)量增加率:
成活率/%=(n1/n)×100%
質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%
式中,n為蟹總數(shù)量,n1為生殖蛻殼后的存活數(shù)量,m1為生殖蛻殼前的體質(zhì)量,m2為生殖蛻殼后體質(zhì)量。
1.3.2 卵巢指數(shù)和組織學(xué)
試驗(yàn)過(guò)程中,根據(jù)中華絨螯蟹完成生殖蛻殼的時(shí)間,每5~10 d解剖1次。解剖后取出每只蟹的全部卵巢,電子天平稱量質(zhì)量(精確至0.01 g)后計(jì)算卵巢指數(shù)。
卵巢指數(shù)/%=m3/m×100%
式中,m為蟹體質(zhì)量,m3為卵巢質(zhì)量。
對(duì)波恩氏液固定的卵巢組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片,切片厚度5.0~7.0 μm,蘇木精—伊紅染色后中性樹(shù)膠封片,隨后在顯微鏡下進(jìn)行觀察(Leica DM2500,德國(guó)徠卡公司),并采用自動(dòng)數(shù)碼攝像系統(tǒng)(Leica DFC295)進(jìn)行拍照和圖片處理。參考文獻(xiàn)[10-11]的分期方法將中華絨螯蟹卵巢進(jìn)行分期,并在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)切片上15~20個(gè)卵細(xì)胞的卵徑。各期的組織學(xué)特征為:Ⅰ期,卵巢內(nèi)的主要細(xì)胞類型卵原細(xì)胞和卵黃合成前卵母細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)呈嗜堿性;Ⅱ期,卵巢內(nèi)可見(jiàn)大量橢圓形的內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞(EN),細(xì)胞質(zhì)呈嗜堿性;Ⅲ期,卵巢內(nèi)主要細(xì)胞類型是外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞(EX),胞質(zhì)嗜堿性減弱并向嗜酸性轉(zhuǎn)變;Ⅳ期,卵巢內(nèi)為不規(guī)則的近成熟期卵母細(xì)胞(NO),胞質(zhì)呈嗜酸性,且胞質(zhì)內(nèi)含有大顆粒卵黃物質(zhì);Ⅴ期,卵巢內(nèi)為成熟卵母細(xì)胞(MO),卵黃顆粒較大且較均勻分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。
所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足齊性方差時(shí)對(duì)百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或者平方根處理,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析, 采用Tukey s-b(K)法進(jìn)行多重比較;當(dāng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后仍不滿足齊性方差時(shí),采用Games-Howell非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著, 在Excel軟件上繪制相關(guān)圖表。
對(duì)雌體生殖蛻殼后的質(zhì)量增加率和成活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),在本試驗(yàn)條件下生殖蛻殼后雌體的平均質(zhì)量增加率為(54.60±4.93)%;而平均成活率為(71.11±3.85)%。
中華絨螯蟹雌體在生殖蛻殼后20 d內(nèi)卵巢發(fā)育較為緩慢(圖1)。其中在中華絨螯蟹生殖蛻殼后10 d,雌體的平均卵巢指數(shù)為(0.45±0.02)%,而生殖蛻殼后20 d的雌體平均卵巢指數(shù)為(1.48±0.05)%。隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行,卵巢發(fā)育進(jìn)入快速階段,生殖蛻殼后30 d雌體的平均卵巢指數(shù)為(2.05±0.21)%,至生殖蛻殼后40 d,雌體平均卵巢指數(shù)已顯著增至(2.53±0.72)%。隨著卵巢的進(jìn)一步發(fā)育,待生殖蛻殼后50 d,雌體的平均卵巢指數(shù)已為(6.83±0.51)%。至生殖蛻殼后60 d,雌體卵巢指數(shù)進(jìn)一步增至(7.43±0.23)%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹雌體的卵巢指數(shù)和生殖蛻殼后的時(shí)間呈顯著正相關(guān)(P<0.05,n=19)。兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90)。就卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑而言,中華絨螯蟹卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑與其生殖蛻殼后的時(shí)間亦呈顯著正相關(guān),待生殖蛻殼后60 d時(shí), 雌體卵母細(xì)胞的長(zhǎng)徑可高達(dá)280 μm,兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)(圖2)。
圖2 群體養(yǎng)殖中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑的變化
組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹生殖蛻殼后10 d的卵巢處于卵巢發(fā)育的Ⅱ期早期,卵巢中的細(xì)胞類型為卵黃合成前卵母細(xì)胞(PRO)和內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞(EN)(圖3a)。生殖蛻殼后20 d的雌體卵巢亦處于卵巢發(fā)育的Ⅱ期,但卵巢中的主要細(xì)胞類型已轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞(圖3b)。隨后,卵巢進(jìn)入快速發(fā)育時(shí)期,生殖蛻殼后30 d雌體的卵巢發(fā)育至Ⅲ期,卵巢中的主要細(xì)胞類型為外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞(EX)(圖3c)。至生殖蛻殼后40 d的卵巢中的細(xì)胞類型仍為外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞(圖3d)。待生殖蛻殼后50 d,雌體的卵巢已經(jīng)發(fā)育至Ⅳ期,卵巢中的細(xì)胞類型為近成熟期卵母細(xì)胞(NO)(圖3e)。至生殖蛻殼后60 d,可觀察到近成熟期卵母細(xì)胞內(nèi)的卵黃物質(zhì)進(jìn)一步均質(zhì)化(圖3f)。
圖3 群體養(yǎng)殖中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后卵巢組織學(xué)的變化
甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)是通過(guò)周期性的蛻殼來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而生殖蛻殼是蟹類由亞成體到成體階段的最后一次蛻殼[3,6-7]。本研究結(jié)果表明,室內(nèi)聚乙烯桶養(yǎng)雌體生殖蛻殼后的平均成活率為71.11%,其高于土池養(yǎng)殖中華絨螯蟹[12]生殖蛻殼后成活率(59.2%)。此外,本試驗(yàn)中每隔8 h觀察一次,發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹蛻殼后立即將其保護(hù)起來(lái),也保證了中華絨螯蟹生殖蛻殼后的成活率。本試驗(yàn)中中華絨螯蟹生殖蛻殼后的平均質(zhì)量增加率為54.60%,這與土池養(yǎng)殖中華絨螯蟹[12]的質(zhì)量增加率接近。
甲殼動(dòng)物的卵巢發(fā)育過(guò)程非常復(fù)雜,其受到溫度、鹽度、光照周期和餌料等多種因素的綜合調(diào)控[13-14]。一般認(rèn)為生殖蛻殼是蟹類卵巢發(fā)育的起點(diǎn),生殖蛻殼后蟹類卵巢開(kāi)始快速發(fā)育[12,15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,中華絨螯蟹雌體在生殖蛻殼后20 d內(nèi)卵巢內(nèi)的卵母細(xì)胞類型主要為內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞,且卵巢指數(shù)增長(zhǎng)緩慢,這可能是因?yàn)椋?1)中華絨螯蟹雌體剛剛生殖蛻殼后,需要完成從內(nèi)源性卵黃合成期到外源性卵黃合成期的轉(zhuǎn)變,濾泡細(xì)胞遷移到卵母細(xì)胞四周需要一個(gè)過(guò)程[11];(2)剛剛生殖蛻殼后的中華絨螯蟹雌體需要優(yōu)先在肌肉和肝胰腺中積累較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),才能保證其后續(xù)正常卵巢發(fā)育[17]。隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行,卵巢發(fā)育進(jìn)入快速階段,卵母細(xì)胞由內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞發(fā)育為近成熟期卵母細(xì)胞,且卵巢指數(shù)急劇增加。
綜上,本試驗(yàn)進(jìn)一步探明了中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育規(guī)律,這為中華絨螯蟹養(yǎng)殖管理、育肥和捕撈上市等提供基礎(chǔ)資料和實(shí)踐依據(jù)。中華絨螯蟹生殖蛻殼后20 d內(nèi)卵巢發(fā)育較為緩慢,隨后進(jìn)入快速發(fā)育階段,因此在今后的中華絨螯蟹養(yǎng)殖管理中,在中華絨螯蟹生殖蛻殼后的一段時(shí)間內(nèi)應(yīng)投喂足量的餌料以滿足中華絨螯蟹后續(xù)的卵巢發(fā)育需求。此外,筆者通過(guò)規(guī)律間斷采樣探明中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育規(guī)律,為今后科研工作中選擇不同卵巢發(fā)育階段的中華絨螯蟹雌體提供了參考資料。
將體質(zhì)量為50~70 g的中華絨螯蟹雌蟹亞成體在室內(nèi)放置遮蔽物的聚乙烯水桶中養(yǎng)殖至生殖蛻殼后,取出30只雌體繼續(xù)養(yǎng)殖60 d發(fā)現(xiàn),卵巢指數(shù)和生殖蛻殼后的時(shí)間呈顯著正相關(guān),兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90),卵母細(xì)胞長(zhǎng)徑與其生殖蛻殼后的時(shí)間亦呈顯著正相關(guān),兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)。