康 琴，葉琳洋，徐玉姍，牟 莉

(長春大學(xué) 食品科學(xué)工程學(xué)院，吉林 長春 130022)

植物纖維素資源是世界上最豐富的生物資源之一。將植物纖維素資源轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)化工產(chǎn)品的糖是數(shù)十年來科學(xué)研究的核心，有助于解決化石能源稀缺和全球環(huán)境變化的問題[1]。在全球范圍內(nèi)，植物纖維素的利用率很低。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，擁有豐富的植物纖維素資源，其中玉米秸稈高居首位。合理利用纖維素酶降解玉米秸稈，既有利于減少玉米秸稈處理不當(dāng)而造成的環(huán)境污染，又能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益[2-3]。

目前在實驗研究中使用的植物纖維素降解方法主要有三大類：物理法(微波、超聲、高溫?zé)峤?、化學(xué)法(酸法、堿法)、生物降解法(酶法等)[4]。研究表明，在纖維素經(jīng)生物酶降解的過程中，反應(yīng)條件方便控制，反應(yīng)過程溫和，并且沒有產(chǎn)生有毒污染物[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈(長春市小合隆)、市售纖維素酶(和氏璧生物工程有限公司，75 000 μ/g)、3，5-二硝基水楊酸試劑、鹽酸稀溶液、氫氧化鈉稀溶液。

還原糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液：利用電子秤精確地稱取1 g還原糖并移至1000 mL的容量瓶中，將溶質(zhì)利用一定量的蒸餾水?dāng)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜量潭?，制? mg/mL的還原糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存?zhèn)溆谩?/p>

還原糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別取還原糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL)20、40、60、80 mL置于100 mL容量瓶中，配制成0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗儀器

PTY-A220型電子秤：華志電子科技有限公司；pH計：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：揚州昌哲試驗機(jī)械有限公司；掃描電鏡：日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米秸稈降解

分別稱取粉碎后的玉米秸稈1 g，倒入燒杯，加入蒸餾水50 mL，再分別加入纖維素酶，在酶解溫度、酶解時間、pH值變化的條件下進(jìn)行酶降解，然后吸取1 mL酶降解液，加入DNS試劑后利用紫外分光光度計測定OD值，再代入公式計算還原糖濃度[6-8]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線建立

分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL酶降解液于15 mL的玻璃試管中，使用移液槍添加蒸餾水,補足至1 mL后在每支玻璃試管中準(zhǔn)確加入2 mL的DNS試劑，放置于備好的沸水中加熱，5 min后取出，利用流水冷卻。從每支玻璃試管中各取1 mL，加9 mL的去離子水，然后在540 nm波長下分別測定OD值。以測定的吸光度OD值為縱坐標(biāo)、還原糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)[9]，繪制實驗的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖1。

圖1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 單因素實驗

各影響因素的取值范圍：酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃；pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；酶解時間為100、110、120、130、140 min；酶用量為0.08、0.09、0.10、0.11、0.12 g。

1.3.4 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計[10-12]，還原糖濃度為秸稈降解效果的響應(yīng)值，A代表pH值、B代表酶解時間、C代表酶解溫度、D代表酶量，將其設(shè)定為4個考察因素，確定因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖的測定

根據(jù)回歸方程：y=0.6939X+0.0022，R2=0.9969，測定還原糖濃度。

2.2 影響玉米秸稈降解的因素分析

2.2.1 優(yōu)化纖維素酶的酶解溫度對降解玉米秸稈的影響

從圖2可以看出，酶解溫度對玉米秸稈降解的效果較為顯著。在溫度低于55 ℃時，隨著溫度上升，秸稈降解中還原糖濃度曲線趨向上升；當(dāng)酶解溫度達(dá)到55 ℃時，還原糖濃度出現(xiàn)最佳值；溫度超過55 ℃后，還原糖濃度曲線開始下降，可能是由于溫度過高使纖維素酶逐漸失活。

圖2 酶解溫度對秸稈降解還原糖濃度的影響

2.2.2 優(yōu)化纖維素酶的酶解pH值對降解玉米秸稈的影響

在酶解的溫度、時間等用量和酶條件保持不變時，只調(diào)整pH值，從圖3可以看出，還原糖濃度先升后降，曲線呈拋物狀，表明優(yōu)化的酶解pH值對降解有較好的作用。從曲線形態(tài)來看，在pH值小于5.5的情況下，還原糖濃度逐漸上升；在pH值等于5.5時，還原糖濃度達(dá)到最高值；隨著pH值逐漸偏向中性時，還原糖濃度開始降低。因此，以酯活力為75 000 μ/g的纖維素酶降解玉米秸稈，pH值為5.5較適宜。

圖3 pH值對秸稈降解還原糖濃度的影響

2.2.3 優(yōu)化纖維素酶的酶解時間對降解玉米秸稈的影響

從圖4可以看出，酶解時間對秸稈降解過程中還原糖濃度有較大影響。在酶解溫度、酶用量、酶解pH值都保持不變時，酶解時間小于120 min時，還原糖濃度逐漸增加；在酶解時間為120 min時，還原糖濃度達(dá)到最高值；當(dāng)酶解時間大于120 min時, 還原糖濃度逐步下降。因此，酶解時間在120 min時，降解效果最好。

2.2.4 優(yōu)化纖維素酶的添加量對降解玉米秸稈的影響

從圖5可以看出，降解過程中以纖維素酶加入量為0.1 g時出現(xiàn)的峰值為節(jié)點，以每0.01 g的量繼續(xù)添加，還原糖濃度隨著添加量的增加不斷上升，含量達(dá)到0.161 mg/mL。當(dāng)纖維素酶的加入量達(dá)到一定值后，還原糖濃度出現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象。因此，75 000 μ/g 纖維素酶降解效果以酶用量0.10 g/g秸稈為宜。

圖4 酶解時間對秸稈降解還原糖濃度的影響

圖5 酶用量對秸稈降解還原糖濃度的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

選用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗[13]，以還原糖濃度為響應(yīng)值Y，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到一個二次多元回歸方程。該方程可以預(yù)測給定區(qū)間內(nèi)還原糖的濃度，分析得到回復(fù)方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9355, 校正后的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.8562。

Y=0.16+0.001917A-0.00125B-0.00017C+0.004D-0.0005AB-0.00325AC-0.002AD+0.00025BC-0.001BD+0.0015CD-0.01541A2-0.01316B2-0.016C2-0.014D2

表2 正交試驗結(jié)果

續(xù)表2:

根據(jù)表3，試驗所得模型對玉米秸稈降解的影響較顯著(P<0.01)；試驗誤差較小，未知因素對此次試驗結(jié)果的干擾近似忽略，失擬項中P>0.05，差異不顯著；R2=0.9355，表明該模型能夠反映還原糖濃度的響應(yīng)情況，擬合的情況適合該試驗，利用該模型分析還原糖濃度可行。

2.3.2 響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析

選用Design-Expert 8.0.6軟件的降維分析，得到等高線圖和響應(yīng)面圖，可以據(jù)此判斷各因素之間的交互作用。

圖6中的等高線呈橢圓形，響應(yīng)面圖中曲面呈拋物面狀，可見酶解pH值和時間對還原糖濃度有較大的影響。當(dāng)pH值一定時，秸稈與纖維素酶反應(yīng)時間越長，還原糖濃度的值越大；當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到120分鐘時，拋物線出現(xiàn)峰值；超過120分鐘后，隨著時間增加，還原糖濃度越來越低。當(dāng)反應(yīng)時間保持不變時，曲面隨著pH值的加大而趨向上升；當(dāng)pH值大于5.5時，曲線開始下降。綜合來看，酶解時間與pH值之間的作用對秸稈降解有顯著的影響。

表3 還原糖濃度方差分析

圖6 酶解PH值與時間對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應(yīng)面圖

圖7中等高線呈明顯的橢圓形，響應(yīng)面圖呈拋物狀，表示pH值及溫度在秸稈降解的過程中交互作用極為顯著。當(dāng)pH值一定時，隨著溫度逐漸上升，還原糖濃度明顯提高；當(dāng)溫度高于55 ℃時，拋物線開始降低；當(dāng)溫度恒定、pH值為5.5時，曲線出現(xiàn)峰值；當(dāng)pH值小于5.5時，拋物線逐漸上升；當(dāng)pH值大于5.5時，拋物線開始下降。由此可見，最適溫度為56 ℃左右、最適pH值為5.5時，兩者的交互作用對秸稈降解的作用明顯。

圖8中的等高線呈橢圓形，表明酶用量與酶解pH對秸稈降解的影響顯著。當(dāng)pH值一定時，酶用量在0.09～0.10 g，還原糖量隨酶用量的增加而逐漸增加，在0.1 g時達(dá)到最大值；酶用量在0.1～0.11 g，拋物線趨于平緩并下降。因此，加入適當(dāng)數(shù)量的酶可以提高秸稈的降解率。當(dāng)酶的添加量一定時，pH值對還原糖濃度影響呈拋物線狀。隨著溶液pH值的升高，還原糖濃度先升高后降低，在pH值為5.5左右達(dá)到最大值。

圖9中的等高線呈橢圓形，交互影響圖呈明顯的拋物狀。酶解溫度、時間對秸稈降解的作用明顯，對還原糖濃度有較大的影響。當(dāng)時間一定時，隨著溫度升高，還原糖濃度逐漸提高，且還原糖濃度在55～56 ℃時達(dá)到最高值；當(dāng)溫度不變時，隨著酶解時間的增加，拋物線先上升后降低?？梢?，溫度在降解中的作用大于時間的作用。

圖7 酶解pH值與溫度對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應(yīng)面圖

圖8 酶解pH值與酶用量對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應(yīng)面圖

圖9 酶解溫度與時間對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應(yīng)面圖

圖10中的等高線呈較明顯的圓形，說明纖維素酶的加入量與時間之間的相互作用不強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)時間一定時，拋物線隨著酶用量的增加而逐漸升高；當(dāng)酶的加入量超過0.1 g時，還原糖濃度出現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)酶的加入量不變時，還原糖濃度隨酶解時間的增加先升高后趨于穩(wěn)定，在120 min時達(dá)到最高值。兩個因素對秸稈降解的相互作用不明顯。

根據(jù)圖11，等高線與交互影響的響應(yīng)面圖對還原糖濃度的交互作用的顯著性較小。等高線趨于圓形，表明交互的作用小。當(dāng)酶的加入量在0.09～0.1 g時，拋物線不斷上升；酶的加入量>0.1 g時，拋物線逐漸降低。當(dāng)酶的添加量不變時，拋物線隨著溫度升高而上升；在55～56 ℃時，還原糖濃度出現(xiàn)峰值；溫度持續(xù)升高，還原糖濃度開始變小。

圖10 酶解時間與酶用量對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應(yīng)面圖

圖11 酶解溫度與酶用量對降解玉米秸稈中還原糖濃度的響應(yīng)面圖

未被降解的秸稈掃描電鏡圖 經(jīng)過纖維素酶酶解的秸稈掃描電鏡圖圖12 秸稈掃描電鏡圖

2.3.3 反應(yīng)前后秸稈掃描電鏡圖對比

根據(jù)圖12中的左圖，未經(jīng)纖維素酶降解的玉米秸稈中的纖維素分為結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)。在結(jié)晶區(qū)中，分子鏈光滑平整，布列整齊、緊密。在纖維素?zé)o定形區(qū)，分子鏈排列較松散。右圖顯示，秸稈降解后表面已經(jīng)被嚴(yán)重破壞，結(jié)晶區(qū)與無定形區(qū)沒有差別,纖維束斷裂、粗糙，出現(xiàn)了空化現(xiàn)象。利用纖維素酶降解，對打開秸稈的糖苷鍵有明顯的促進(jìn)作用，因此可以提高降解率[14]。

2.4 驗證實驗

利用響應(yīng)面軟件建立秸稈降解的最優(yōu)條件如下：pH值為5.53,酶解時間為119.47 min，酶解溫度為54.98 ℃，酶用量為0.1 g/g秸稈。此時，還原糖濃度達(dá)到最大值，為0.160 777 mg/mL。根據(jù)響應(yīng)面所建立的最優(yōu)降解條件在實際操作中難以控制，故將優(yōu)化的降解條件調(diào)整如下：pH值為5.5，酶解時間為120 min，酶解溫度為55 ℃，酶用量為0.1 g/g秸稈。根據(jù)調(diào)整后的最優(yōu)條件，進(jìn)行3組平行驗證實驗，測定OD值，計算出還原糖的濃度分別為0.162、0.161、0.159 mg/mL，平均值為0.1 606 mg/mL，實際值與響應(yīng)面建立的擬合較好，從而驗證了利用該模型進(jìn)行秸稈降解的可行性。

3 結(jié)論

本研究運用響應(yīng)面法對市售的這種纖維素酶降解玉米秸稈的條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確立酶促反應(yīng)最佳條件如下：pH值為5.5，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為120 min，酶用量為0.10 g/g秸稈。此時降解后的秸稈中還原糖濃度為0.161 mg/mL。纖維素是取之不盡的天然資源，面對日益嚴(yán)重的能源短缺問題，我們要深入研究可再生能源，積極探索秸稈的處理工藝。