雷 杰,黎維維,歐陽(yáng)陳琳,馬先奎,王 剛

(遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,貴州遵義 563000)

翠云草(Selaginellauncinata),又名龍須、藍(lán)草、劍柏,是卷柏科卷柏屬多年生草本植物[1-2]。翠云草具有清熱解毒、化痰止咳、清熱利尿、利水消腫之功效。臨床上多用于治療急性黃疸型傳染性肝炎,膽囊炎,腸炎,痢疾,腎炎水腫,泌尿系感染,肺結(jié)核咯血等癥[3-4]。

關(guān)于翠云草的研究現(xiàn)主要集中于化學(xué)成分和生物活性方面。伍曉群等[5]采用大孔吸附樹(shù)脂、Sephadex LH-20柱色譜及制備高效液相色譜等分離技術(shù),從翠云草75%乙醇提取物中鑒定出10種化學(xué)成分,主要含高級(jí)烷烴、醇、酚類化合物等。賴紅芳等[6]研究了翠云草不同提取溶劑的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)60%甲醇提取物抗氧化活性效果最好;肖凌等[7]從翠云草中分離出4個(gè)雙黃酮類化合物,分別是羅波斯塔雙黃酮-4′-甲醚、2,3,2″,3″-四氫穗花杉雙黃酮、2,3-二氫穗花杉雙黃酮、2,3-二氫穗花杉雙黃酮-4′-甲醚;在抗菌活性方面,吳穎瑞等[8]發(fā)現(xiàn)翠云草乙醇提取物對(duì)海豚鏈球菌有較強(qiáng)的抑制作用(MIC與MBC值分別為10,17.5 mg/mL)。目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道翠云草揮發(fā)油成分及生物活性。

本課題組以翠云草為原料,采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油,用GC-MS分離定性,進(jìn)行體外抗氧化和抗菌活性試驗(yàn),旨在為翠云草這一傳統(tǒng)中藥材的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翠云草 購(gòu)自貴州遵義中藥材市場(chǎng),經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)張玉金老師鑒定為真品;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;TPTZ(2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪) 購(gòu)自于北京百靈威科技有限公司;菲洛嗪 購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;維生素C(VC) 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)股份有限公司;EDTA(乙二胺四乙酸) 購(gòu)自重慶九龍化學(xué)試劑廠;標(biāo)準(zhǔn)菌種(金黃色葡萄球菌 ATCC 25623、糞腸球菌 ATCC 29212、化膿性棒狀桿菌 ATCC 6051、大腸桿菌 ATCC 25922、銅綠假單胞 ATCC 19420、普通變形桿菌 CMCC 51352) 購(gòu)自于成都金盛科技有限公司;三氯化鐵、無(wú)水硫酸鈉、正己烷、無(wú)水乙醇、醋酸鈉 均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)自于貴州三力試劑公司。

HP6890/5975CGC/MS聯(lián)用儀 購(gòu)自美國(guó)Agilent公司;SC-3614型中草藥粉碎機(jī) 購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司;759型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì) 購(gòu)自上海箐華科技儀器有限公司;FA1004B電子分析天平 購(gòu)自上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;98-1-B型電子恒溫電熱套 購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司;揮發(fā)油提取器 購(gòu)自北京欣威爾儀器有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱 購(gòu)自美國(guó)Forma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 翠云草揮發(fā)油的制備 稱取100 g樣品,粉碎過(guò)80目篩后在蒸餾水中浸泡2 h,在100 ℃微沸狀態(tài)下用蒸餾水提取6 h,收集餾出液,再用正己烷萃取3次,合并萃取液加入無(wú)水硫酸鈉干燥,再進(jìn)行減壓濃縮回收正己烷,得到淺黃色有特殊香氣的翠云草揮發(fā)油0.52 g,得率為0.52%,重復(fù)三次提取,密封0～5 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀工作條件 色譜條件[9]:HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀,色譜柱為ZB-5MSI 5%,Phenyl-95% Di-Methylpolysiloxane(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,初始溫度54 ℃,保持2 min,以8 ℃/min升溫至126 ℃后,然后以4 ℃/min升溫至226 ℃,最后以8 ℃/min升溫至306 ℃,保持8 min,運(yùn)行時(shí)間:54 min;汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He(99.999%);柱前壓7.65 psi,載氣流量1.0 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,分流比20∶1,溶劑延遲時(shí)間:4.0 min。質(zhì)譜條件:離子源為EI源;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓1482 V;接口溫度280 ℃;質(zhì)量范圍29～500 amu。定性分析是通過(guò)HP6890/5975C化學(xué)工作站檢索Wiley7Nist05質(zhì)譜圖庫(kù)和Nist05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)解析,要求匹配度大于80%[10],半定量分析按峰面積歸一化法計(jì)算出各揮發(fā)性成分的相對(duì)百分含量。

1.2.3 抗氧化能力測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]方法稍作修改,分別量取2 mL不同濃度(0.02～0.12 mg/mL)的揮發(fā)油無(wú)水乙醇稀釋液與2 mL DPPH溶液(0.04 mg/mL)混合均勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1,同法測(cè)定2 mL乙醇加樣液的吸光度A2,以及2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水的吸光度A0,以維生素C作為對(duì)照,樣品對(duì)DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100。

1.2.3.2 FRAP測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12]方法稍作修改,精密量取25 mL 醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)、2.5 mL TPTZ溶液和2.5 mL的FeCl3溶液按(10∶1∶1)的比例混合均勻,現(xiàn)用現(xiàn)配。吸取不同濃度(0.1×10-3～0.8×10-3mmol/L)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL,加入3 mL FRAP溶液,再加入0.3 mL蒸餾水,混勻準(zhǔn)確反應(yīng)8 min。以蒸餾水為空白,在593 nm處測(cè)定吸光度。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=0.7865x+0.0916(R2=0.9995)。取不同濃度(0.02～0.12 mg/mL)的揮發(fā)油稀釋液0.1 mL于試管中,加3 mL FRAP溶液,再加入0.3 mL蒸餾水,混勻后反應(yīng)8 min,以維生素C為對(duì)照,在波長(zhǎng)593 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3.3 金屬離子螯合能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]方法稍作修改,取不同濃度(0.02～0.12 mg/mL)的揮發(fā)油稀釋液1 mL于試管中,加入0.05 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)、2.8 mL蒸餾水和0.15 mL的菲洛嗪溶液(0.1 mmol/L),混勻后室溫放置10 min,于分光光度計(jì)562 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。以相同濃度的EDTA做陽(yáng)性對(duì)照,以相同方法測(cè)定其金屬離子螯合能力;以蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照,測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。金屬活性按該式計(jì)算:螯合率(%)=(A0-A1)/A0× 100。

1.2.4 抗菌能力測(cè)定

1.2.4.1 供試菌懸液和揮發(fā)油供試品溶液的制備 將試驗(yàn)所有菌種分別取200 μL接種于10 mL肉湯培養(yǎng)基中,在35 ℃下活化18 h,然后根據(jù)0.5麥?zhǔn)蠞舛葮?biāo)準(zhǔn)調(diào)整細(xì)菌濃度,置于4 ℃冰箱中備用。將制得的翠云草揮發(fā)油按照倍比稀釋法,用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑,將其稀釋成40、20、10、5、2.5、1.25 μL/mL 6個(gè)濃度梯度的溶液。

1.2.4.2 揮發(fā)油抑菌活性的測(cè)定 采用紙片擴(kuò)散法[13]。取翠云草揮發(fā)油原油100 μL滴到直徑為6.0 mm的濾紙片上,貼于用100 μL細(xì)菌懸液涂布的平板上,以純DMSO作為對(duì)照,將其在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。由此測(cè)量抑菌圈的直徑,重復(fù)3次。

1.2.4.3 揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]的步驟并稍作修改。將翠云草揮發(fā)油稀釋液分別加入菌懸液,37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察結(jié)果,無(wú)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌沉淀所對(duì)應(yīng)的濃度為最小抑菌濃度(MIC)。取MIC對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液100 μL接種到肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,培養(yǎng)基上沒(méi)有觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)三次,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 8.5軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析

對(duì)翠云草揮發(fā)油的分析,共分離出52個(gè)峰,并通過(guò)氣相色譜面積歸一法計(jì)算出揮發(fā)性成分在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量總離子流圖見(jiàn)圖1,具體分析結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,有50種成分被鑒別出,鑒出化合物的相對(duì)含量占到總峰的98.58%,揮發(fā)油成分主要包括萜類,脂肪酸及高級(jí)脂肪烴類化合物。在已鑒定的化合物中,相對(duì)百分量在1%以上的有15種,占被檢出物質(zhì)總量的86.03%,其主要的化學(xué)成分包括植酮(21.40%)、角鯊烯(8.53%)、棕櫚酸(6.71%)、二十八烷(6.03%)等,其中含量最高的為植酮(21.40%)。

表1 翠云草揮發(fā)油的化學(xué)組分

圖1 翠云草揮發(fā)油總離子流圖

續(xù)表

最近研究表明,植酮是維生素E醋酸酯的中間體,同時(shí)也是煙草煙氣重要的特征香成分,具有一定的抗腫瘤活性[15-16]。角鯊烯是人體膽固醇代謝途徑中一個(gè)關(guān)鍵的中間產(chǎn)物,是所有類固醇類物質(zhì)的生物合成前體,具有殺菌、增強(qiáng)細(xì)胞的活力及免疫力、抑制癌細(xì)胞生成及防止癌細(xì)胞擴(kuò)散等作用,還有較好的養(yǎng)顏、潤(rùn)膚等功效,應(yīng)用于化妝品、保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[17-18];棕櫚酸用作沉淀劑、化學(xué)試劑及防水劑,其生理學(xué)和藥理學(xué)活性十分廣泛,還具有抗腫瘤作用,作用于乳腺癌和結(jié)腸癌[19-20]。

2.2 抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 翠云草揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除能力 由圖2可知,當(dāng)翠云草揮發(fā)油濃度在0.02～0.12 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基清除率不斷增大,當(dāng)濃度為0.12 mg/mL時(shí),翠云草揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除率為65.28%,而維生素C對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)80.78%,翠云草揮發(fā)油清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50為0.76 mg/mL,維生素C的IC50為0.44 mg/mL,兩者比較,翠云草揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除能力較弱于維生素C。以上結(jié)果顯示,翠云草揮發(fā)油具有較好的DPPH自由基清除作用。

圖2 揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除率

2.2.2 翠云草揮發(fā)油的抗氧化活性 由圖3可知,當(dāng)翠云草揮發(fā)油濃度在0.02～0.12 mg/mL時(shí),對(duì)鐵離子的還原能力不斷增大,當(dāng)濃度為0.12 mg/mL時(shí),翠云草揮發(fā)油的FRAP值為0.86 mmol/L,而維生素C的FRAP值為0.89 mmol/L,兩者比較,翠云草揮發(fā)油對(duì)鐵離子還原能力較弱于維生素C。以上結(jié)果顯示,翠云草揮發(fā)油對(duì)鐵離子具有良好的還原作用。

圖3 樣品溶液和對(duì)照品溶液FRAP值比較

2.2.3 翠云草揮發(fā)油對(duì)金屬離子的螯合能力 由圖4可知,當(dāng)翠云草揮發(fā)油濃度在0.06～0.12 mg/mL時(shí),對(duì)金屬離子螯合能力不斷增大,當(dāng)濃度為0.12 mg/mL時(shí),翠云草揮發(fā)油對(duì)金屬離子螯合率為63.60%,而EDTA對(duì)金屬離子螯合率可達(dá)68.75%,翠云草揮發(fā)油對(duì)金屬離子螯合能力的半數(shù)抑制濃度EC50為0.71 mg/mL,EDTA的EC50為0.32 mg/mL,兩者比較,翠云草揮發(fā)油對(duì)金屬離子螯合能力較弱于EDTA。以上結(jié)果顯示,翠云草揮發(fā)油具有較好的金屬離子螯合能力。

圖4 翠云草揮發(fā)油對(duì)金屬離子的螯合作用

2.3 抗菌活性測(cè)定

通過(guò)測(cè)定翠云草揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、化膿棒狀桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌的抑菌圈直徑大小、最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC),比較翠云草揮發(fā)油對(duì)這6種供試菌的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 翠云草揮發(fā)油抗菌活性測(cè)試

總體而言,翠云草揮發(fā)油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用優(yōu)于對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用。其中,翠云草揮發(fā)油對(duì)糞腸球菌的抑制作用最強(qiáng)(抑菌圈直徑為17.94 mm,MIC為5 μL/mL,MBC為10 μL/mL),其次是化膿棒狀桿菌(抑菌圈直徑為14.63 mm,MIC為10 μL/mL,MBC為20 μL/mL),對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌也有一定的抑制作用,但是當(dāng)翠云草揮發(fā)油濃度達(dá)到最大時(shí),金黃色葡萄球菌和變形桿菌的MIC值尚未獲得,所以翠云草揮發(fā)油對(duì)這兩種細(xì)菌的抑菌作用較差。

3 結(jié)論

通過(guò)以上研究可知,利用GC-MS對(duì)翠云草揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析,鑒定出50個(gè)組分,占總峰面積98.58%,主要化學(xué)成分為:植酮、角鯊烯、棕櫚酸、二十八烷等。翠云草對(duì)DPPH自由基清除能力,鐵離子還原能力及金屬離子螯合作用的實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出較好的效果;翠云草揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抑菌活性,對(duì)糞腸球菌的抑菌作用最強(qiáng),其次是化膿棒狀桿菌。以上結(jié)論說(shuō)明翠云草揮發(fā)油是一種有待開(kāi)發(fā)的具有抗氧化和抗菌作用的天然活性物質(zhì),由于翠云草揮發(fā)油的組分種類豐富多樣,其抗氧化抗菌的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。