孫穎瑛,許艷順,夏文水,姜啟興,高 沛

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇無錫 214122)

我國淡水魚資源豐富,種類多、產(chǎn)量大,但是由于淡水魚水分含量高,肌間刺多,土腥味重等問題,加工利用受到了嚴(yán)重制約[1]。發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的食品加工和保藏技術(shù),利用發(fā)酵技術(shù)有助于解決這些問題[2]。酸魚是我國具有地方民族特色的傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品之一,以鯉魚或草魚為原料,經(jīng)宰殺、腌制后與炒熟的谷物混合后密封發(fā)酵而成。發(fā)酵成熟的酸魚酸香爽口、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味濃郁,深受消費者的喜愛[3]。近年來,關(guān)于發(fā)酵魚制品的研究逐年增加,但現(xiàn)有的研究主要集中在發(fā)酵菌株的篩選、發(fā)酵工藝的改善以及對發(fā)酵過程中微生物、風(fēng)味、脂質(zhì)、蛋白、亞硝胺等的變化研究[4-9],目前關(guān)于發(fā)酵魚在貯藏流通過程中的品質(zhì)變化及貨架期的報道甚少。

發(fā)酵魚中具有豐富的微生物和酶,在貯藏和流通過程中會對發(fā)酵魚中營養(yǎng)成分組成和感官品質(zhì)產(chǎn)生影響,而溫度是影響微生物和酶活性的重要因素之一[10-11]。市售的酸魚產(chǎn)品貯藏條件多為冷藏和常溫,相同貯藏條件產(chǎn)品的保質(zhì)期也有較大的差異。明確不同貯藏條件下發(fā)酵酸魚的品質(zhì)變化特性對科學(xué)制定產(chǎn)品貯運條件和確定產(chǎn)品貨架期至關(guān)重要。因此,本文以感官評價、失水率、全質(zhì)構(gòu)、蛋白質(zhì)組成、微觀結(jié)構(gòu)等為主要指標(biāo)評價,重點評價了發(fā)酵酸魚在冷藏(4 ℃),室溫(25 ℃)和極端溫度(35 ℃)不同貯藏溫度條件下的品質(zhì)穩(wěn)定性,旨在為提高發(fā)酵酸魚的貯藏穩(wěn)定性和科學(xué)制定產(chǎn)品貨架期提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚、玉米粉、香辛料、調(diào)味料 均購于無錫歐尚超市(高浪店);發(fā)酵菌株 酵母菌、乳酸菌和葡萄球菌(1∶1∶1)混合,由本研究室于中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚中分離純化制備;真空袋 中國美吉斯;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、無水乙醇、甲苯、冰乙酸、十二烷基硫酸鈉(SDS) 均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;4K-15型高速冷凍離心機 德國Sigma公司;YMX-958-10L型真空包裝機 泉州億閩信機電有限公司;單臂機型物性分析儀 英國SMS公司;4K15冷凍離心機 美國sigma公司;IKA-T10高速分散機 德國IKA集團;1150H徠卡石蠟包埋機 德國徠卡公司;PM2245徠卡手動輪轉(zhuǎn)切片機 德國徠卡公司;尼康ECLIPSE Ci生物顯微鏡 日本尼康株式會社;SCIENTZ-10ND凍干機 寧波新芝生物科技股份有限公司;su1510掃描電子顯微鏡 日本日立株式會社。

1.2 發(fā)酵魚的制備與貯藏試驗

鯉魚:鮮活鯉魚,去魚鱗魚脊骨、魚頭魚尾和內(nèi)臟后,清洗,切塊,瀝干,按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計,加入3%的食鹽,2%的白砂糖,2%的香辛料,攪拌混勻,置于4 ℃腌制48 h后,于烘箱50 ℃烘4 h,烘干后魚肉水分含量為68%～72%左右。

玉米粉:玉米粉中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的食鹽,2%的白砂糖,小火炒35 min,冷卻至室溫,接入活化的發(fā)酵菌株,充分混合后與冷卻至室溫的魚肉混合(烘干后魚肉質(zhì)量∶玉米粉質(zhì)量=4∶1)。

在發(fā)酵壇底部鋪上一層玉米粉后一層魚一層玉米粉壓緊,頂部鋪上玉米粉后壓實,加蓋加水密封,置于25 ℃下發(fā)酵5周。將發(fā)酵成熟的酸魚去除表面粘附的玉米粉后真空包裝,于4、25和35 ℃貯藏,貯藏過程中定期取樣分析。

1.3 分析方法

1.3.1 感官評價 發(fā)酵酸魚的感官評價參照于美娟等[6]的分析方法。在酸魚貯藏0、45和90 d期間對其外觀、滋味、氣味和口感進行感官評分分析,將酸魚切成1 cm×1 cm×1 cm的小塊,由挑選的12名(6男6女,年齡均在20～35歲之間)受過專業(yè)培訓(xùn)的感官評定人員組成的評定小組對樣品的外觀、滋味、氣味和口感進行感官評定(總體可接受度為25%外觀+25%滋味+25%氣味+25%口感),評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵魚感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 失水率 失水率測定采用如下公式:

式中:W1-貯藏前發(fā)酵魚塊的質(zhì)量,g;W2-貯藏后發(fā)酵魚塊的質(zhì)量,g。

1.3.3 全質(zhì)構(gòu)分析 將魚肉切成1.5 cm×1 cm×1 cm的小塊,通過質(zhì)構(gòu)儀測定發(fā)酵魚肉的硬度、彈性、內(nèi)聚性、粘著性、膠黏性和咀嚼性。測試條件:采用圓柱型測試探頭p/35,測試前速度為5 mm/s,測試速度為1 mm/s,測試后速度為5 mm/s,壓縮形變50%,觸發(fā)力5 g,每個樣品重復(fù)5次。

1.3.4 蛋白質(zhì)組成 參考王蔚新[12]的方法提取發(fā)酵魚肉中各組分蛋白。稱取2 g攪碎的魚肉,加入20 mL 0.02 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.5),均質(zhì)1 min,10000×g離心20 min,重復(fù)提取兩次,合并上清液即為肌漿蛋白抽提液。剩余的沉淀部分繼續(xù)加入20 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.5,含0.7 mol/L NaCl),均質(zhì)1 min,10000×g離心20 min,重復(fù)提取兩次,合并上清液即為肌原纖維蛋白提取液。沉淀部分重新懸浮于20 mL 5% SDS溶液,85 ℃水浴加熱1 h后用自來水冷卻,即為不溶性蛋白。各蛋白組分的含量采用雙縮脲法測定。

1.3.5 SDS-PAGE分析 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析全蛋白[3]。準(zhǔn)確稱取2.0 g魚肉,加入18 mL 5% SDS溶液,均質(zhì)后于85 ℃水浴加熱1 h后用自來水冷卻,將蛋白抽提液與2×樣品緩沖液等體積均勻混合,煮沸4 min后待測。濃縮膠濃度為5%,分離膠的濃度為10%,待凝固后上樣。濃縮膠部分電壓穩(wěn)定在80 V、分離膠部分電壓調(diào)節(jié)為120 V。電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍R250染色液染色2 h,然后用脫色液過夜脫色。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu) 微觀結(jié)構(gòu)參照高琪等[13]的分析方法,并進行了一些改進。選取魚背肉,切成2 mm×5 mm×5 mm小塊,用carnoy溶液(60%無水乙醇,30%甲苯,10%冰乙酸)固定24 h,無水乙醇脫水2 h,50%無水乙醇和50%無水甲苯混合溶液浸泡12 h,無水甲苯透明4 h,石蠟浸泡包埋在徠卡手動輪轉(zhuǎn)切片機上制備10 μm厚的超薄切片,用毛刷將切片轉(zhuǎn)移至40 ℃水浴鍋中展開貼片,隨后將載玻片置于70 ℃烘箱中脫蠟1 h,無水甲苯洗脫20 min,無水乙醇、50%乙醇和去離子水各洗脫10 min,使用1%伊紅染色后,用生物顯微鏡觀察(放大倍數(shù)10×10)觀察拍照。

1.3.7 掃描電鏡 選取魚背部肌肉,切成3 mm×6 mm×6 mm小塊,用10%戊二醛固定3 d,乙醇梯度脫水,于-50 ℃預(yù)凍12 h,凍干48 h,用金涂覆至10 nm的厚度。通過掃描電子顯微鏡在電壓為20 kV下分別放大500和5000倍觀察魚肉組織結(jié)構(gòu)特征。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0和Microsoft Excel 2016進行處理和分析,結(jié)果表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用鄧肯多重分析(Duncan multiple analysis)進行組間顯著性分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度和時間對酸魚感官品質(zhì)的影響

感官評分是發(fā)酵魚貯藏期間重要的評價指標(biāo)之一,直接影響消費者的接受性。酸魚的感官評分結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,貯藏溫度越高,時間越長,則酸魚的感官評分越低。隨著貯藏溫度的升高,貯藏時間的增加,從魚肉中遷移出來的水分越多,酸魚的外觀品質(zhì)和口感越差。在4 ℃貯藏90 d后酸魚的感官品質(zhì)變化較小,酸香味和口感保持較好,總體可接受度相對較高。在25 ℃貯藏45 d后總體可接受度相對較高,但是在貯藏90 d后口感評分下降較明顯,魚塊表面潮濕,肉質(zhì)軟膩,總體可接受度降低。在35 ℃貯藏45 d時,發(fā)酵酸魚的感官品質(zhì)已經(jīng)出現(xiàn)明顯劣化,表觀變差,顏色變深,肉質(zhì)變軟,從魚肉中滲出水分較多。

圖1 發(fā)酵酸魚儲藏過程中的感官分析比較

綜上所述,從感官品質(zhì)方面可知冷藏(4 ℃)是最佳的保藏方式;在貯藏過程中發(fā)酵魚肉的外觀和口感是感官劣化的主要方面,均受時間和溫度影響較大。Mario等[14]和KameníK等[15]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵香腸貯藏過程中也有相似結(jié)果,貯藏溫度越高,則顏色和口感方面劣化明顯,感官品質(zhì)越差。

2.2 貯藏溫度和時間對酸魚物性指標(biāo)的影響

2.2.1 貯藏失水率 發(fā)酵魚在貯藏過程中的失水率如表2所示,隨著貯藏時間的延長,發(fā)酵酸魚的失水率呈上升趨勢,隨著貯藏溫度的升高,發(fā)酵魚的失水率增加。在整個貯藏過程中,貯藏前30 d失水率增加相對顯著(P<0.05)。4、25和35 ℃貯藏90 d后的發(fā)酵魚失水率由最初的2.72%分別增加至4.14%、6.76%和9.51%。pH是影響肌肉蛋白持水性的主要因素之一,酸性條件下蛋白變性導(dǎo)致持水性下降。此外,在貯藏過程中魚肉肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生了一定程度的變性與降解,肌原纖維發(fā)生了收縮,引起可存儲水分的網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)變小,也會導(dǎo)致失水率增加[16-18]。失水率的增加引起魚肉中水分向外遷移至包裝袋中,導(dǎo)致酸魚感官品質(zhì)的可接受程度也隨之降低。

2.2.2 質(zhì)構(gòu)分析 質(zhì)構(gòu)是評價魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,發(fā)酵魚在貯藏過程中質(zhì)構(gòu)變化如表3所示。貯藏早期是硬度變化的主要階段,低溫貯藏的樣品具有相對穩(wěn)定的質(zhì)構(gòu)。在貯藏過程中,發(fā)酵魚在4、25和35 ℃貯藏30 d后的樣品硬度值分別上升至最初硬度值的1.23、1.32和1.41倍,30 d后硬度的變化趨于平緩(P>0.05),且貯藏溫度越高,發(fā)酵魚的硬度值越大。貯藏期間硬度值的增加主要與貯藏過程中水分的流失有關(guān),溫度越高則失水率越高,因此溫度越高則硬度值越大。李苗云等[19]在火腿腸的貯藏過程中也有相似的研究結(jié)果。在貯藏過程中發(fā)酵魚肉的彈性和黏聚性值的變化較小,貯藏期間所有樣品的彈性值在0.44～0.67范圍內(nèi),而黏聚性值在0.43～0.58范圍內(nèi)。與25和35 ℃貯藏的樣品相比,4 ℃貯藏的樣品在整個貯藏過程中具有相對穩(wěn)定的咀嚼度值(P>0.05)。

表3 發(fā)酵魚在貯藏過程中全質(zhì)構(gòu)的變化

2.3 貯藏溫度和時間對酸魚蛋白質(zhì)的影響

2.3.1 蛋白質(zhì)組成 蛋白質(zhì)是魚肉的主要組分,與發(fā)酵酸魚品質(zhì)變化密切相關(guān)。魚肉中蛋白質(zhì)可以分為肌漿蛋白(sarcoplasmic protein)、肌原纖維蛋白(myofibrillar protein)和不溶性蛋白(insoluble protein)。肌漿蛋白是水溶性蛋白,存在于肌細(xì)胞間及肌原纖維間;肌原纖維蛋白屬于鹽溶性蛋白,存在于肌原纖維中;而不溶性蛋白是不能溶于鹽溶液和堿溶液的蛋白組分,主要包括由網(wǎng)狀蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白組成的基質(zhì)蛋白和變性蛋白[20-21]。酸魚各蛋白組分在貯藏過程中的含量變化如表4所示。

表4 發(fā)酵魚在貯藏過程中蛋白組成的變化

從表4可以看出,在貯藏過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量均隨著貯藏時間的延長而降低,貯藏90 d后,分別下降至貯藏前樣品的53.46%～69.50%和63.29%～70.16%,而不溶性蛋白含量隨貯藏時間的延長而增加,90 d后增加至貯藏前樣品的1.13～1.38倍。貯藏溫度越高,蛋白組成變化越大,低溫可以有效延緩蛋白組分的變化。不同蛋白組分含量變化,一方面可能是由于水溶性蛋白隨著水分的遷移而部分滲出,另一方面酸魚在儲藏過程中pH維持在4.0左右,酸性條件下肌漿蛋白和肌原纖維蛋白發(fā)生變性和聚集,從而導(dǎo)致不溶性蛋白質(zhì)增加[22-23]。

2.3.2 蛋白電泳 采用SDS-PAGE電泳對發(fā)酵魚在保藏過程中的全蛋白變化進行了分析。由圖2可知,貯藏時間對蛋白條帶的影響較小,貯藏溫度對蛋白條帶的影響較大。與剛發(fā)酵成熟酸魚的蛋白電泳條帶圖相比,4 ℃貯藏的樣品在貯藏45和90 d后蛋白條帶顏色變淺,但條帶數(shù)量的變化較小;25 ℃貯藏的樣品蛋白條帶顏色變淺,25～37 kDa之間的條帶變窄;而相對于其它組樣品,35 ℃貯藏的樣品在貯藏45 d后,全蛋白20～25 kDa之間、37 kDa左右、75～250 kDa之間的蛋白條帶消失,25～37 kDa之間、37～75 kDa之間的蛋白條帶變窄,顏色變淺。根據(jù)電泳圖發(fā)現(xiàn),發(fā)酵酸魚在貯藏過程中蛋白有一定程度的降解,35 ℃蛋白降解更加劇烈,這主要與內(nèi)源性組織蛋白酶和微生物蛋白酶的作用將魚肉蛋白形成小分子肽和游離氨基酸等有關(guān)[24]。

圖2 發(fā)酵酸魚儲藏過程中的全蛋白電泳圖譜

2.4 貯藏溫度和時間對酸魚組織結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 光學(xué)顯微結(jié)構(gòu) 組織結(jié)構(gòu)是影響肉制品口感的主要因素。發(fā)酵酸魚在貯藏過程中微觀組織結(jié)構(gòu)的變化如圖3所示。由圖可知,三種貯藏溫度下發(fā)酵魚肉的組織結(jié)構(gòu)變化趨勢相似。剛發(fā)酵成熟的魚肉肌肉纖維排列致密整齊,纖維間隙少且小。隨著貯藏時間的延長,肌纖維內(nèi)部間隙逐漸增大,貯藏溫度越高則肌纖維內(nèi)部間隙越大。貯藏過程中由于蛋白質(zhì)降解和酶的作用,魚肉肌纖維和連接肌纖維的肌膜逐漸脫離,形成纖維間間隙,貯藏溫度越高,單個肌纖維收縮越劇烈,肌纖維直徑越小,間隙越大[25]。

圖3 發(fā)酵魚在貯藏過程中微觀組織結(jié)構(gòu)的變化(100×)

2.4.2 掃描電鏡分析 貯藏溫度對發(fā)酵魚超微結(jié)構(gòu)的影響顯著,圖4是發(fā)酵魚發(fā)酵成熟和不同溫度下貯藏90 d后的500×和5000×的掃描電鏡圖,從圖中可以很直觀地觀察到發(fā)酵魚貯藏90 d后肌肉纖維的變化。掃描電鏡放大500倍觀察,剛發(fā)酵成熟的酸魚樣品肌纖維相對緊密,裂縫相對較少,貯藏90 d后的樣品貯藏溫度越高肌肉裂縫間距越大。35 ℃肌肉收縮,肌膜松散,肌纖維之間的間距增大,與光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果基本一致。在放大5000倍的圖像中可以觀察到剛發(fā)酵完成的酸魚樣品纖維結(jié)構(gòu)相對平整,4 ℃貯藏的樣品次之,25和35 ℃貯藏的樣品肌肉纖維斷裂相對明顯。貯藏過程中,發(fā)酵魚肉中蛋白質(zhì)的降解導(dǎo)致了肌肉組織結(jié)構(gòu)變化,肌肉的肌節(jié)發(fā)生了聚合或收縮,進而加大了肌纖維間間隙,酶的作用也會降解結(jié)締組織導(dǎo)致肌纖維與肌膜發(fā)生脫離,增大間隙[26-27]。

圖4 發(fā)酵魚在貯藏過程中掃描電鏡圖

3 結(jié)論

發(fā)酵酸魚在4、25和35 ℃貯藏90 d,貯藏溫度和時間均對發(fā)酵魚的感官品質(zhì)、物性特征、蛋白質(zhì)和微觀組織結(jié)構(gòu)有顯著的影響。貯藏溫度越高,則發(fā)酵魚的感官品質(zhì)劣化越嚴(yán)重,貯藏過程中失水率越多,硬度越大,蛋白質(zhì)降解越劇烈,微觀結(jié)構(gòu)變化越大。隨著貯藏時間的延長,感官品質(zhì)發(fā)生劣化,肌漿蛋白和肌原纖維蛋白逐漸變性聚集,不溶性蛋白逐漸增加,肌纖維間間隙不斷變大,水分流失和硬度的變化主要發(fā)生在貯藏前期。低溫(4 ℃)有助于保持發(fā)酵魚產(chǎn)品的感官品質(zhì)和質(zhì)構(gòu),減少水分流失,延緩蛋白的降解和肌肉纖維結(jié)構(gòu)的變化。隨著貯藏時間的延長,發(fā)酵魚的品質(zhì)整體上會發(fā)生不同程度的下降,但4 ℃冷藏產(chǎn)品整體品質(zhì)相對穩(wěn)定。