石力勻,王 政，何松林,2，李玲達，王勝楠,孫 暢,楊 博

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450000； 2.河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453000；3.河南雞公山國家級自然保護區(qū)管理局，河南 信陽 464133)

月季(Rosahybrida)是薔薇科薔薇屬植物，被譽為花中皇后。因其是日中性植物(Day-neutral plant)，開花受自身發(fā)育狀態(tài)的控制，在適宜的溫度下可四季開花，成為我國重要的切花品種和經(jīng)濟花卉之一[1]。月季的生長發(fā)育是一個復(fù)雜的形態(tài)發(fā)生與自身生理生化調(diào)節(jié)的過程，受許多因素的影響，除了本身的營養(yǎng)狀況外，外部環(huán)境對其生長發(fā)育也有著重要影響[2]。不適宜的生長環(huán)境如高溫、高濕等會引起月季植株發(fā)育異常，導(dǎo)致花朵畸形，引發(fā)切花月季的生理性病害，嚴重影響其觀賞品質(zhì)及商品價值。

植物的外部形態(tài)和內(nèi)部細胞結(jié)構(gòu)的變化是植株生理生化變化的反映，植物體內(nèi)的激素變化、遺傳特性和環(huán)境影響往往相互作用，從而引起形態(tài)發(fā)生上的變化。彎?，F(xiàn)象(Bent peduncle phenomenon,BBP)是月季花朵常見的生理性畸形之一，不同于月季花朵采后由于水分脅迫引起的彎頸現(xiàn)象，彎?，F(xiàn)象出現(xiàn)在植株的生長過程中，子房下方的花梗朝一側(cè)彎曲，并且導(dǎo)致花不能正常開放或花姿不整，影響切花的觀賞價值和產(chǎn)量[3]。因此，研究彎?，F(xiàn)象引起的內(nèi)外部形態(tài)變化可進一步揭示切花月季在各種因素影響下形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)變化的原因和機制。本研究以切花月季品種卡羅拉(Rosahybrida‘Carolla’)為試驗材料，觀察其在不同季節(jié)生長溫度下的彎梗率，對比彎梗植株及正常植株的生長形態(tài)和內(nèi)部解剖形態(tài)，以期為研究月季彎梗現(xiàn)象的發(fā)生原因、形成機制以及提高切花月季的栽培品質(zhì)提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)置與材料

2017年10月—2018年11月，在河南省濮陽市源龍鄉(xiāng)切花月季溫室設(shè)置無線測溫系統(tǒng)(CWT-04,HEBIDA，中國)，監(jiān)測溫室的溫度，并于此期間每月1次，對切花月季卡羅拉的彎梗率進行統(tǒng)計，彎梗率=彎梗植株/總植株×100%。

切花月季卡羅拉于2018年9月采自河南省濮陽市源龍鄉(xiāng)切花月季溫室。選取健康生長的正常植株及彎?；蔚闹仓旮?0株，30株用于形態(tài)特征觀察，10株在拍照后切取適宜大小的組織塊置于戊二醛固定液中固定保存。

1.2 觀察方法

1.2.1 彎梗外部形態(tài)特征觀察 隨機選取月季正常及彎梗植株各30株，萼片的名稱按照COOK[4]定義的萼片順序來編號。觀察彎梗的方向、1號萼片變形的形態(tài)、萼瓣的形態(tài)等，并對正常植株和彎梗植株的形態(tài)拍照記錄，使用游標卡尺測量花梗高度、1號萼片下落距離、花朵寬度、花朵高度、子房高度、子房寬度，使用YMJ-B型葉面積測試儀測量1號萼片的面積以及用量角器測量彎梗植株的彎梗角度。

1.2.2 掃描電鏡樣品的制備與觀察 選取正常及彎梗植株的1號萼片、萼瓣、花瓣、子房下方1～2 cm處的花梗等，分別放于預(yù)冷的載玻片上，用刀片切成邊長小于5 mm、厚小于2 mm的小塊，快速投入用 0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配制的2.5%戊二醛溶液中于4°保存固定。然后用 pH值7.2的PBS沖洗3次，每次30 min，依次用 30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水各3次，每次20 min。使用3∶1、1∶1、1∶3的乙醇∶乙酸異戊酯(體積比)各置換1次，每次15 min，用 Hitachi HCP-2型臨界點干燥器進行干燥，噴金后用SEM S-3400N型掃描電鏡(Hitachi,東京,日本)進行觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

外部形態(tài)統(tǒng)計共30個重復(fù)，花梗的細胞形態(tài)共10個重復(fù)，所有數(shù)據(jù)采用平均值，并采用Duncan’s 新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS (Version 9.3,SAS Institute Inc.,Cary,北卡羅來納州,美國)，作圖采用Sigmaplot 14.0(Systat Software Inc.,圣何塞,美國) 進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)月季彎梗率統(tǒng)計

從圖1可以看出，月季的彎?，F(xiàn)象周年均可發(fā)生，彎梗率的變化趨勢與溫室溫度的變化趨勢趨于一致。隨著溫室溫度的升高，彎梗率呈現(xiàn)增長的趨勢。其中，6—8月3個月的彎梗率均超過20%，顯著高出其他月份(P<0.05)。6月溫室最高溫度大于30 ℃的有26 d，7月有28 d，8月有24 d。由此可知，夏季高溫是誘導(dǎo)切花月季卡羅拉彎?，F(xiàn)象發(fā)生的重要因素，這也與ZACCAI等[3]、SEO等[5]發(fā)現(xiàn)的當(dāng)溫度高于30 ℃時彎梗現(xiàn)象發(fā)生概率顯著增加的現(xiàn)象一致。

2.2 月季彎?，F(xiàn)象外部形態(tài)比較

2.2.1 月季彎?，F(xiàn)象外部形態(tài)觀察 月季的彎?；维F(xiàn)象如表1、圖2所示，與正常植株相比，彎梗植株的花梗長度較短，子房下方0.5～2.0 cm處的花梗向一側(cè)彎曲(圖2B-1)，形成了5°～90°的夾角(平均36.22°)。同時，彎曲部分的莖發(fā)育變形，形成扁平的花梗(圖2B-2)。COOK[4]將月季的5片萼片按照形態(tài)進行了定義，正常植株的1、2號萼片的兩邊皆有羽狀裂片，3號萼片僅一邊有羽狀裂片，而 4、5號萼片兩邊則是光滑的(圖3A)。由表1可知，彎梗植株的1號萼片相較于其他 4 片萼片下移了平均0.63 cm，與正常植株的1號萼片相比，萼片面積顯著增大2.8倍，并發(fā)生一定比例的葉變(Phyllody)現(xiàn)象，形成了單葉、3小葉、5小葉等不同的形態(tài)(圖4)。同時，原本1號萼片出現(xiàn)的位置被半瓣半萼或者萼瓣狀(Sepalody)的器官替代，其特點是萼片和花瓣狀的結(jié)構(gòu)同時出現(xiàn)在同一瓣器官上(圖3B—H)。

圖1 溫室周年溫度變化(A)及切花月季卡羅拉彎梗率變化(B)(2017-10—2018-11)Fig.1 Seasonal change in temperature(A) and bent peduncle rate(B) of cut rose Carolla(2017-10—2018-11)

表1 切花月季卡羅拉正常植株與彎梗植株的生長形態(tài)比較Tab.1 Comparison of growth characteristics between normal flower and BBP flower of cut rose Carolla

圖2 切花月季卡羅拉正常植株(A)和彎梗植株(B)Fig.2 Normal flower(A) and BBP flower(B) of cut rose Carolla

2.2.2 彎梗現(xiàn)象引起的萼片異位表達情況 同時發(fā)現(xiàn)，1號萼片的葉變引發(fā)了其他4片萼片及花器官的異位表達。一種是其他4片萼片大概率異位(60%以上)呈逆時針方向，如60%的2號萼片變成4號萼片(圖5A)，60%的3號萼片變成5號萼片(圖5B)，80%的4號萼片變成3號萼片(圖5C)，而70%的5號萼片變成2號萼片(圖5D)。一種是其他4片萼片一定概率異位(10%～30%)，整體為不定向性，如2號萼片可能會變成1、5號萼片，3號萼片變成2號萼片，4號萼片變成5號萼片，5號萼片變成4號萼片。

圖3 切花月季卡羅拉正常植株(A)與彎梗植株(B—H)萼片的形態(tài)比較Fig.3 Comparison of sepal patterns between normal flower(A) and BBP flower(B—H) of cut rose Carolla

圖4 切花月季卡羅拉彎梗植株萼片的異位表達形態(tài)Fig.4 The morphology of ectopic expression in BBP flower of cut rose Carolla

A:2號萼片變成4號萼片比例；B:3號萼片變成5號萼片比例；C:4號萼片變成3號萼片比例；D:5號萼片變成2號萼片比例A:The rate of No.2 sepal transformed into No.4 sepal;B:The rate of No.3 sepal transformed into No.5 sepal;C:The rate of No.4 sepal transformed into No.3 sepal;D:The rate of No.5 sepal transformed into No.2 sepal圖5 切花月季卡羅拉1號萼片異位表達變化率Fig.5 The rate of ectopic expression on sepal 1 in BBP flower of cut rose Carolla

2.2.3 彎?，F(xiàn)象引起的花發(fā)育變化情況 彎曲的花梗嚴重影響了花朵的發(fā)育，彎梗植株的花瓣數(shù)量較正常植株減少19.51%，花朵鮮質(zhì)量減少34.01%，花朵寬度及花高也顯著降低，分別減少14.70%和21.47%。同時，彎梗植株子房形態(tài)也發(fā)生了明顯變化，子房的寬度顯著增大，但高度顯著降低，寬高比較正常植株增大1.73倍，且子房質(zhì)量變化不大(表2)。

表2 切花月季卡羅拉正常植株與彎梗植株的花朵與子房形態(tài)比較Tab.2 Comparison of flower bud and ovary characteristics between normal flower and BBP flower of cut rose ‘Carolla’

2.3 月季彎?，F(xiàn)象解剖結(jié)構(gòu)觀察

正常植株的花瓣上表皮的細胞向外呈五邊形或六邊形半球狀突起，排列緊密，間隙小，突起基本在一個水平面上，突起表面由條紋狀皺褶構(gòu)成(圖6A-1)，花瓣的下表皮則由無規(guī)則的皺褶和大小不一的腔構(gòu)成(圖6A-2)[6]。圖6B是彎梗植株中替代1號萼片出現(xiàn)的半瓣半萼組織，萼瓣的上表皮細胞也向外突起，但彎梗植株半球狀的突起皺褶與正?；ò甑募毎黄鹣啾让黠@增加，且突起不在一個水平面上，從花瓣向萼片過渡的過程中突起逐漸平緩，完全變成平整的褶皺并出現(xiàn)毛狀組織(圖6B-1)。萼瓣的下表皮也出現(xiàn)了類似的過渡現(xiàn)象，花瓣部分的褶皺消失，只有緊鄰的腔結(jié)構(gòu)，且腔結(jié)構(gòu)逐漸模糊，出現(xiàn)飽滿的圓型毛狀組織(圖6B-2)。正常植株的1號萼片的上下表皮細胞結(jié)構(gòu)如圖6C所示，萼片上表皮細胞呈不規(guī)則形狀，并可見有少量氣孔分布(圖6C-1)，而萼片的下表皮布滿毛狀組織，與萼瓣的下表皮相比，毛狀組織密度顯著增加，且為扁平狀(圖6C-2)。而彎梗植株的1號萼片發(fā)生了葉變并下落，發(fā)生葉變的1號萼片上表皮細胞皺起且無氣孔分布(圖6D-1)，而下表皮細胞分布有密集的氣孔，且氣孔密度顯著大于正常植株的1號萼片(圖6D-2)，細胞特征與月季的葉片相近[7-8]。

A-1:正常植株花瓣上表皮;A-2:正常植株花瓣下表皮;B-1:彎梗植株萼瓣上表皮;B-2:彎梗植株萼瓣下表皮;C-1:正常植株1號萼片上表皮;C-2:正常植株下表皮;D-1:彎梗植株葉變的1號萼片上表皮;D-2:彎梗植株葉變的1號萼片下表皮

與正常植株相比，彎梗植株子房下方0.5～2.0 cm處的花梗部分發(fā)生彎曲，圓柱形花梗變得扁平。彎梗植株與正常植株花梗的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有顯著的差異，彎梗植株彎梗處的韌皮層明顯增厚，為8.78 mm，是正常植株韌皮層的3.7倍(表3)。同時該彎梗處的維管束變高，比正常植株的維管束高出49.5%，由扁圓形變?yōu)榻鼒A形。彎梗植株的厚壁組織細胞顯著增大且數(shù)量增加，1號萼片下落側(cè)的厚角組織內(nèi)側(cè)多出了一塊高約4 mm、寬約7 mm排列緊密的細小細胞，增加的細胞組織造成了花梗向彎曲側(cè)突起(圖7)，是導(dǎo)致花梗呈扁平狀的原因。

表3 切花月季卡羅拉正常植株與彎梗植株的花梗細胞形態(tài)比較Tab.3 Comparison of cells characteristics between normal flower and BBP flower of cut rose Carolla

圖7 切花月季卡羅拉正常植株(A)和彎梗植株(B)的花梗橫切形態(tài)比較Fig.7 Comparison of transverse section of normal flower(A) and BBP flower(B) peduncle of cut rose Carolla

3 結(jié)論與討論

月季的成花是一個復(fù)雜的多層次、多元化反應(yīng)過程[9]。月季生長期的溫度對花芽的分化與生長發(fā)育都有一定的影響，進而影響了其外觀品質(zhì)及商業(yè)價值。月季適宜生長溫度為日平均溫度10～25 ℃，當(dāng)生長溫度低于5 ℃，或超過30 ℃后會處于休眠或半休眠狀態(tài)，花芽停止分化，較難生產(chǎn)出枝條長度、花苞大小符合要求的高品質(zhì)花枝[10]。目前切花月季生產(chǎn)可實現(xiàn)周年供應(yīng)，但夏季高溫嚴重的影響了植株正常生長，嚴重時會導(dǎo)致月季出現(xiàn)變?nèi)~病[11-12]和彎梗[3,5]等畸形現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，切花月季卡羅拉在夏季6—8月的高溫環(huán)境下彎梗率顯著提高，由此可見，高溫是導(dǎo)致月季彎?，F(xiàn)象發(fā)生的重要環(huán)境誘因。

本研究發(fā)現(xiàn)，月季彎梗植株的花器官表達出現(xiàn)葉變、異位和萼瓣化現(xiàn)象。在葉變方面，其1號萼片發(fā)生葉變現(xiàn)象，萼片面積增大，上下表皮細胞與正常植株1號萼片的細胞有明顯差異，下表皮的毛狀結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)了密集的氣孔，與葉片的細胞結(jié)構(gòu)相近，并形成了形態(tài)不同的小葉；1號萼片的著生位置也發(fā)生了變化，正常月季植株中完整的合萼在彎?；伟l(fā)生時，1號萼片會脫離其他4瓣萼片，發(fā)生高度不等的下落現(xiàn)象。同時，該現(xiàn)象可引發(fā)60%以上概率的其他4個萼片逆時針的異位表達，而1號萼片本應(yīng)著生的位置則被萼瓣狀的器官替代，同時出現(xiàn)萼片和花瓣2種組織結(jié)構(gòu)，其萼瓣的上表皮細胞呈現(xiàn)出從突起到平坦的過程，褶皺顯著增加，下表皮則出現(xiàn)了與萼片相同的毛狀組織。COOK[4]和BOND[13]分別在1926年和1945年報道過這種萼片葉變的現(xiàn)象，認為激素在月季植株從營養(yǎng)生長到生殖生長過程中的不均衡分布是萼片葉變的主要原因，同時引發(fā)了花瓣的萼瓣化。月季中的另一種常見的生理畸形變?nèi)~病也會出現(xiàn)花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊等花器官全都被含有葉綠素和氣孔的類似葉片的結(jié)構(gòu)所替代的現(xiàn)象[14]，高溫是引起變?nèi)~病的重要原因之一，高溫引發(fā)了月季植株體內(nèi)細胞分裂素含量的分布不均，導(dǎo)致了花器官的葉變[11,15-16]。而花瓣中出現(xiàn)萼片結(jié)構(gòu)的萼瓣現(xiàn)象被報道也與溫度與激素相關(guān)[17-19]。萼片對植物的生長和發(fā)育有著重要作用，萼片的不正常發(fā)育會導(dǎo)致月季花朵的畸形[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫條件引起月季彎梗植株的萼片出現(xiàn)異位表達現(xiàn)象，并進一步導(dǎo)致花朵變小，花瓣明顯減少。

花梗是月季花器官與莖的連接部，起到支撐花器官和調(diào)節(jié)水分傳輸?shù)淖饔?，在植株的生長和花器官的發(fā)育過程中扮演著重要的角色[22]，花梗部與莖部的發(fā)育結(jié)構(gòu)不同，莖部具有發(fā)育更為完善的環(huán)狀木質(zhì)部，植物管細胞的直徑較大，而花梗維管組織的發(fā)育較弱，有著較為不成熟的纖維素，維管組織呈不連續(xù)的束狀，細胞較莖部顯著減少并變小[23-24]。這些組織結(jié)構(gòu)上的差異使得花梗部更易受到生長環(huán)境及其他因素的影響[25]。生長素與赤霉素會影響花梗部的酶活性進而影響花梗部木質(zhì)素與纖維素的產(chǎn)生[26-27]。月季的花器官同樣是生長素和赤霉素的來源[28]，有研究顯示，花器官中的激素也參與了調(diào)節(jié)花梗部維管組織的分生與發(fā)育[29]。同時，當(dāng)植株受到脅迫時，植株會放棄花器官的發(fā)育來保護整株植株的生長[21]。本試驗中月季正常植株與彎梗植株的花梗部也有顯著的不同，彎梗植株的維管束發(fā)生變形，更接近圓形，同時韌皮層增厚，厚壁組織細胞顯著增大且數(shù)量增加，1號萼片側(cè)的厚角組織內(nèi)側(cè)則增長了塊狀的細胞組織，內(nèi)部的細胞形態(tài)變化使得彎梗植株的花梗在外部形態(tài)上呈扁平狀，并朝1號萼片下落側(cè)呈5°～90°的夾角。因此，本研究推測，月季在受到高溫脅迫時，花器官與花梗相互制約可能導(dǎo)致調(diào)節(jié)激素濃度分布時出現(xiàn)了不均勻現(xiàn)象，進而導(dǎo)致了彎梗畸形現(xiàn)象的發(fā)生。有研究表明，如果在月季正常植株的花梗部注射生長素，會出現(xiàn)跟畸形花類似的彎折現(xiàn)象，花梗會朝與注射側(cè)相反的方向彎折，然而這種現(xiàn)象是臨時性的，70%的彎折梗會在隨后的幾日恢復(fù)正常[3]；同時發(fā)現(xiàn)，正?；ㄖ械腎AA含量在花芽分化前期較高，隨著植株的發(fā)育IAA含量逐漸降低，而彎梗植株中IAA含量始終維持在較高的水平[5]。因此，IAA參與了彎?，F(xiàn)象的發(fā)生。植物花器官的發(fā)育受到MADS-box家族基因的調(diào)控[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，彎梗過程中1號萼片的葉變和其他萼片組出現(xiàn)異位表達現(xiàn)象，這種畸形現(xiàn)象或許與 A 類、B 類功能基因表達異常有關(guān)，其彎梗現(xiàn)象的激素及分子調(diào)控等方面機制有待進一步解析。