曹華金 王艷菊

摘 要：本文利用高效液相色譜，對熱帶假絲酵母Candida tropicalis 2.4491利用單一碳源（葡萄糖、甲醇、乙醇、硬脂酸）、復(fù)合碳源（葡萄糖+甲醇、葡萄糖+乙醇、葡萄糖+硬脂酸）所產(chǎn)有機(jī)酸的種類及含量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明：碳源類型對熱帶假絲酵母代謝產(chǎn)有機(jī)酸的種類及含量具有一定影響，所產(chǎn)有機(jī)酸均以檸檬酸為主，同時含有少量的乙酸、α-酮戊二酸和蘋果酸等。

關(guān)鍵詞：熱帶假絲酵母;有機(jī)酸;碳源

中圖分類號：TQ929文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1003-5168（2020）22-0102-04

Abstract： In this paper， the high performance liquid chromatography （HPLC） was used to detect the types and contents of the organic acids， which were metabolized by Candida tropicalis using the single carbon sources （glucose， methanol， ethanol， stearic acid） and the complex carbon sources （glucose mixed with methanol， ethanol and stearic acid）. The results showed that the types of carbon sources slightly affected the production of organic acids. The main organic acids produced were citric acid in all mediums， with a small amount of acetic acid， α-ketoglutarate and malic acids etc.

Keywords： Candida tropicalis;organic acids; carbon source

深入挖掘微生物學(xué)、生物化學(xué)、代謝組學(xué)等方面的新理論新知識，是開發(fā)新型污水生物處理工藝的核心[1]。酵母菌是一種開發(fā)歷史悠久的模式真菌，因其對污染物、低pH等外界條件耐受度強(qiáng)，且大多廉價易得，生物安全性好，可操作性強(qiáng)，可集污水處理、資源回收利用等多重目標(biāo)于一體，因此具有較大的發(fā)展?jié)摿2-3]。其中，氧化型酵母菌降解廢水中有機(jī)物的代謝機(jī)理是將大分子有機(jī)物通過胞外的水解酶分解成葡萄糖等小分子有機(jī)物，經(jīng)糖酵解方式（EMP途徑）、三羧酸循環(huán)（TCA）等最終轉(zhuǎn)化成CO2和水等，并釋放大量能量，最終實(shí)現(xiàn)有機(jī)污染物的徹底降解。同時，該類酵母菌菌體較大，沉降性能好，易于實(shí)現(xiàn)分離[4]。熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）可代謝葡萄糖、甲醇、乙醇和脂肪酸、烴類等物質(zhì)產(chǎn)TCA循環(huán)中的有機(jī)酸（檸檬酸、異檸檬酸等）[5-6]。研究熱帶假絲酵母產(chǎn)有機(jī)酸的性能，對提高酵母菌處理有機(jī)廢水的效率和開發(fā)污水處理新工藝具有較強(qiáng)的理論及實(shí)踐價值。

本文利用熱帶假絲酵母在不同碳源培養(yǎng)下代謝產(chǎn)有機(jī)酸，并應(yīng)用高效液相色譜對解脂復(fù)膜孢酵母利用不同碳源產(chǎn)生有機(jī)酸的種類和含量進(jìn)行檢測。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 菌種

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）CGMCC 2.4491，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器

碳源（葡萄糖、甲醇、乙醇、硬脂酸）分析純，有機(jī)酸（甲酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸）色譜純，購置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他試劑均為市售分析純。

高壓滅菌鍋YM50A：上海三申醫(yī)療器械有限公司;潔凈工作臺WOL-SY013：廣州沃霖實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;紫外可見分光光度計(jì)Alpha1860S：上海譜元儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱SPX-250B：常州金壇宏華儀器廠;pH計(jì)PHS-25：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;反相高效液相色譜Nexera UHPLC：日本島津。

1.3 培養(yǎng)基

熱帶假絲酵母Candida tropicalis2.4491種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、麥芽浸出粉20 g/L、蛋白胨1 g/L，pH自然，105 ℃滅菌20 min。依據(jù)碳源的不同，Candida tropicalis 2.4491產(chǎn)酸培養(yǎng)基分別為：葡萄糖培養(yǎng)基（GM）、甲醇培養(yǎng)基（MM）、乙醇培養(yǎng)基（EM）、硬脂酸培養(yǎng)基（SM）、葡萄糖+甲醇培養(yǎng)基（GMM）、葡萄糖+乙醇培養(yǎng)基（GEM）、葡萄糖+硬脂酸培養(yǎng)基（GSM）共7個。每個培養(yǎng)基含：碳源20 g/L（葡萄糖20 g/L、甲醇20 g/L、乙醇20 g/L、硬脂酸20 g/L、葡萄糖10 g/L+甲醇10 g/L，葡萄糖10 g/L+乙醇10 g/L，葡萄糖10 g/L+硬脂酸10 g/L），酵母粉0.5 g/L，Mandels微量元素1 mL/L，pH為7。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種培養(yǎng)

種子液制備：斜面活化后的菌種接入種子培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)18 h，作為種子液。發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按1.5%（V/V）的接種量接入250 mL三角瓶中（裝液100 mL），30 ℃、140 r/min培養(yǎng)72 h。

2.2 檢測方法

①還原糖：采用DNS法測定[7]。

②有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：采用超純水配制并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（操作略）。

③有機(jī)酸的HPLC檢測[8]。色譜柱：Eclipse C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 [μm]）;流動相：pH為3.0，CH3OH為3%，KH2PO4為0.10 mol/L;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;柱壓：100 kPa;進(jìn)樣體積：20 [μL]。培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，用一次性無菌注射器（2 mL）配合0.22 [μ]m針筒式有機(jī)膜過濾器直接進(jìn)樣檢測，以峰面積外標(biāo)法定量。

3 結(jié)果與分析

3.1 pH變化

pH值變化曲線如圖1所示。由圖1可知，前24 h，純硬脂酸培養(yǎng)基（SM）為唯一碳源條件下，pH的下降速度低于其他碳源條件下的下降速度;葡萄糖+乙醇（GEM）為碳源時，pH值最低，為2.59。以含葡萄糖為碳源體系的pH均低于不含葡萄糖的體系，說明Candida tropicalis? 2.4491對葡萄糖的利用要優(yōu)先于其他物質(zhì)。72 h時，各體系的pH值均降至2.2左右。

3.2 葡萄糖為唯一碳源條件下有機(jī)酸的變化

葡萄糖為唯一碳源條件下的有機(jī)酸變化如圖2所示。由圖2可知，以葡萄糖為唯一碳源時， Candida tropicalis? 2.4491所產(chǎn)有機(jī)酸較多的為檸檬酸（最大濃度：1.23 g/L）和甲酸（最大濃度：0.78 g/L），但二者隨時間變化的趨勢并不一致。Candida tropicalis? 2.4491所產(chǎn)乳酸的變化趨勢是隨著時間的延長而逐漸遞減的;Candida tropicalis 2.4491也產(chǎn)生少量的乙酸、蘋果酸和α-酮戊二酸，但變化趨勢不顯著。培養(yǎng)前期和中期（0～48 h），檸檬酸的合成速率大于分解速率，檸檬酸快速積累，48 h時濃度達(dá)到最大值（1.23 g/L），之后分解速率大于合成速率，濃度下降。

3.3 甲醇為碳源條件下有機(jī)酸的變化

甲醇為碳源條件下有機(jī)酸的變化如圖3所示。從圖3可知，以甲醇為碳源的兩種條件下，Candida tropicalis 2.4491所產(chǎn)蘋果酸、乳酸、α-酮戊二酸均較低。在以甲醇為唯一碳源條件下，所產(chǎn)有機(jī)酸以琥珀酸為最多，且隨著時間的延長濃度不斷增加，72 h時達(dá)到最大濃度0.56 g/L。同時，在該條件下，所產(chǎn)檸檬酸和乙酸均在48 h以前隨著時間的延長而增大，48 h后呈現(xiàn)相反的變化趨勢。在葡萄糖+甲醇為碳源條件下，所產(chǎn)有機(jī)酸以檸檬酸為最大，且隨著時間的延長濃度不斷增加，72 h時達(dá)到最大濃度0.73 g/L。同時，在該條件下所產(chǎn)甲酸和乙酸在48 h以前隨著時間的延長而增大，48 h后呈現(xiàn)相反的變化趨勢。含葡萄糖的條件下，檸檬酸和乙酸的含量均高于不含葡萄糖的條件，葡萄糖的加入促進(jìn)了檸檬酸和乙酸的積累。

3.4 乙醇為碳源條件下有機(jī)酸變化

乙醇為碳源條件下有機(jī)酸的變化如圖4所示。

由圖4可知，以乙醇為碳源的兩種條件下，Candida tropicalis? 2.4491所產(chǎn)有機(jī)酸均以檸檬酸為最多，且隨著時間的延長濃度不斷增加，72 h時都達(dá)到最大濃度，分別為0.53 g/L（乙醇為唯一碳源）和0.79 g/L（葡萄糖+乙醇為碳源），葡萄糖的加入促進(jìn)了檸檬酸的積累;而乳酸、蘋果酸、α-酮戊二酸含量均較低，且乳酸隨時間延長呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，而蘋果酸隨時間延長逐漸升高，蘋果酸最終濃度均高于乳酸。兩種碳源條件下，乙酸的濃度均隨時間延長而增加，最終濃度均在0.4 g/L左右（72 h）。

3.5 硬脂酸為碳源條件下有機(jī)酸變化

硬脂酸為碳源條件下有機(jī)酸的變化如圖5所示。由圖5可知，以硬脂酸為碳源的兩種條件下，Candida tropicalis? 2.4491所產(chǎn)乳酸、蘋果酸、α-酮戊二酸均較低。在以硬脂酸為唯一碳源條件下，所產(chǎn)有機(jī)酸以檸檬酸為最多，且隨時間延長濃度增加，72 h時達(dá)到最大濃度2.45 g/L。同時，在該條件下所產(chǎn)甲酸和乙酸均在48 h以前隨著時間的延長而增大，48 h后有機(jī)酸濃度下降。在葡萄糖+硬脂酸為碳源的條件下，所產(chǎn)有機(jī)酸以乙酸為最大，且隨時間延長濃度增加，72 h時達(dá)到最大濃度0.73 g/L。同時，在該條件下所產(chǎn)甲酸和乙酸在48 h以前隨著時間的延長而增大，48 h后呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。存在葡萄糖的條件下檸檬酸和乙酸的含量均高于不含葡萄糖的條件，葡萄糖的加入促進(jìn)了檸檬酸和乙酸的積累。

4 結(jié)論

熱帶假絲酵母Candida tropicalis? 2.4491具有獨(dú)特的產(chǎn)有機(jī)酸能力，經(jīng)72 h培養(yǎng)，各碳源體系的pH均從7降至2.2左右，其產(chǎn)有機(jī)酸的主要代謝途徑為三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和乙醛酸循環(huán)。在以單一的葡萄糖、甲醇、乙醇、硬脂酸或其混合物為碳源時，所產(chǎn)有機(jī)酸種類及含量會有所不同，但主要以檸檬酸為主，最高濃度（2.45 g/L）出現(xiàn)在以硬脂酸為碳源的條件下。

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