膠束電動色譜法測定五維他口服溶液中維生素B1、B2、 B6、煙酰胺、泛酸鈣與苯甲酸鈉

李丹鳳，黃羅健，朱健萍，盧日剛*

(1.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021；2.桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林 541100)

五維他口服溶液是由維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣等成分組成的復(fù)方維生素B族口服制劑，主要用于厭食、營養(yǎng)不良、腳氣病、糙皮病及缺乏維生素B族所致的各種疾患的輔助治療[1]，不良反應(yīng)主要有嘔吐、腹瀉、便秘、皮疹、瘙癢、嗜睡、舌麻痹、乏力和呼吸困難等[2]。該制劑屬于多劑量包裝的口服溶液，處方中含有蔗糖，在保存或多次服用過程中易霉變，因此需加入防腐劑苯甲酸鈉。但苯甲酸鈉屬于酸性物質(zhì)，食用太多會增加機體的酸度，從而導(dǎo)致人體內(nèi)碘、鐵、鈣等物質(zhì)過多消耗與流失，且會對人的神經(jīng)系統(tǒng)造成損害[3-4]?，F(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-1001-(HD-0408)-2002[5]采用高效液相色譜法(HPLC)測定五維他口服溶液中B1、B2、B6、煙酰胺的含量，但未對其處方中標(biāo)注的泛酸鈣和苯甲酸鈉進(jìn)行測定。泛酸鈣又名維生素B5，是五維他口服溶液中起藥理作用的主要成分之一。苯甲酸鈉屬于防腐劑，其含量涉及用藥安全，必須建立相關(guān)含量的測定方法。

毛細(xì)管電泳技術(shù)是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間濃度和分配行為上的差異，從而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)[6]，已被廣泛應(yīng)用于苯甲酸、山梨酸、土霉素、人工合成色素和防腐劑等多種物質(zhì)的測定[7-10]。膠束電動色譜(Micellar electrokinetic chromatography，MEKC)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，可用于分離中性溶質(zhì)以及帶電溶質(zhì)。該方法通過在緩沖液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)而形成膠束，由于分析物在溶液和膠束間的分配作用及自身的泳動淌度不同，從而實現(xiàn)聚焦和分離[11]，因此可適用于消栓通絡(luò)片、雷公藤、復(fù)方氨酚烷胺膠囊等藥物中有效成分的測定[12-16]。本研究根據(jù)維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣5個主藥與防腐劑苯甲酸鈉的性質(zhì)，建立了膠束電動色譜法同時測定五維他口服溶液中此6個成分的含量，方法靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7100毛細(xì)管電泳儀，配二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；XD205DU電子天平(感量0.1 mg，梅特勒公司)；Milli-Q 3800超純水機(美國密理博公司)；未涂漬的標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細(xì)管柱(75 μm×50 cm，有效長度42 cm)；維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣、苯甲酸鈉對照品(純度>99.5%,中國食品藥品檢定研究院)；硼砂、硼酸、十二烷基硫酸鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，默克公司)；實驗用水為超純水(電導(dǎo)率小于0.1 μS/cm)；五維他口服溶液(廣西嬋方藥業(yè)股份有限公司，簡稱GXCF，批號：191001、190302；廣東南國藥業(yè)有限公司，簡稱GDNG，批號：190405、190709；江蘇神華藥業(yè)有限公司，簡稱JSSH，批號：190322、190323)。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液的配制精密稱取維生素B1、B2、B6、煙酰胺與泛酸鈣對照品各60、12、18、60、15 mg，分別置于20、20、20、20、50 mL棕色容量瓶中，加20%乙腈水溶解并定容至刻度，搖勻，即得單標(biāo)儲備液。精密稱取苯甲酸鈉對照品30 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入少量20%乙腈水溶解，再精密加入維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣的對照品儲備液各1 mL，再用20%乙腈水定容至刻度，搖勻，即得維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣及苯鉀酸鈉的濃度分別為300、60、90、300、30、3 000 mg/L的混合對照品儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取混合對照品儲備液1.0、1.0、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于50、20、10、10、10 mL棕色容量瓶中，加20%乙腈水稀釋至刻度，得維生素B1與煙酰胺質(zhì)量濃度為6.0、15、30、60、120 mg/L，維生素B2為1.2、3.0、6.0、12、24 mg/L，維生素B6為1.8、4.5、9.0、18、36 mg/L，泛酸鈣為0.6、1.5、3.0、6.0、12 mg/L，苯甲酸鈉為60、150、300、600、1 200 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

精密量取混合對照品儲備液2 mL置于20 mL棕色量瓶中，加20%乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液，過0.45 μm濾膜，超聲脫氣后于4 ℃避光保存，備用，用于精密度計算。

1.2.2 樣品溶液的配制精密量取五維他口服溶液2 mL置于20 mL棕色量瓶中，加20%乙腈水定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，超聲脫氣后于4 ℃避光保存，備用。

1.2.3 陰性樣品溶液的配制按五維他口服溶液的處方配比，稱取蔗糖2.0 g、橙皮酊1.0 g、乙醇2 mL、枸櫞酸1.5 g置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成陰性樣品溶液。精密量取陰性樣品溶液2 mL置于20 mL棕色容量瓶中，加20%乙腈水定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，超聲脫氣后于4 ℃避光保存，備用。

1.3 電泳分離條件

以未涂漬的標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細(xì)管柱(75 μm×50 cm，有效長度42 cm)為分離通道；40 mmol/L硼酸+40 mmol/L硼砂+20 mmol/L 十二烷基硫酸鈉(pH 9.0)為分離緩沖液；分離電壓為20 kV；電動進(jìn)樣：進(jìn)樣電壓10 kV，進(jìn)樣時間為10 s；柱溫25 ℃；維生素B1、B2、B6、煙酰胺和苯甲酸鈉的檢測波長為270 nm；在8.8～10.0 min時切換波長為200 nm，用于檢測泛酸鈣。

新毛細(xì)管使用前用1 mol/L氫氧化鈉沖洗30 min，再用超純水沖洗30 min，使其活化。每次進(jìn)樣前分別用0.1 mol/L氫氧化鈉、超純水、40 mmol/L硼砂+40 mmol/L硼酸+20 mmol/L SDS緩沖液(pH 9.0)各沖洗毛細(xì)管柱5 min，當(dāng)天分析結(jié)束后用1 mol/L氫氧化鈉沖洗30 min，再用超純水沖洗30 min。同一緩沖液在進(jìn)樣5次后必須進(jìn)行更換以保證分析物的保留時間穩(wěn)定。上述溶液及試劑使用前均經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，并超聲脫氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離條件的優(yōu)化

2.1.1 分離緩沖液的優(yōu)化緩沖溶液pH值會影響毛細(xì)管內(nèi)壁的Zeta電位和電滲流，同時改變被測組分在毛細(xì)管內(nèi)的電離狀態(tài)，從而影響被測組分的遷移時間[12]。實驗以40 mmol/L硼砂(pH值為9.3)添加不同體積40 mmol/L硼酸溶液配制不同pH值(7.5、8.0、8.5、9.0、9.3)的緩沖液，考察緩沖液pH值對待測組分峰形及分離度的影響。結(jié)果顯示，pH值對各組分間的分離度和峰形影響較大，pH值為7.5時不能有效分離維生素B6和煙酰胺，且苯甲酸鈉峰形較差；pH值升至8.0時，維生素B6和煙酰胺的分離度良好，但苯甲酸鈉峰形仍得不到改善；pH值為8.5～9.3時，各化合物的峰形及分離度均較好。另外，實驗發(fā)現(xiàn)同濃度硼砂與硼酸等比例混合時pH值恰好均為9.0，綜合考慮各化合物的分離度、峰形、遷移時間以及操作便捷性，選擇緩沖液pH值為9.0。

緩沖液濃度也會影響待測組分的峰形及保留時間，因此實驗考察了終濃度均為20、30、40、50、60 mmol/L的硼砂+硼酸溶液對待測物分離度及峰形的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，緩沖液濃度對待測物峰形影響不大，各峰間的分離度較好，待測物的保留時間隨緩沖溶液濃度的增加而增大。當(dāng)緩沖液濃度大于40 mmol/L時，焦耳熱增大，導(dǎo)致基線噪音增大，且分析物遷移時間變長，不利于分析。因此選擇40 mmol/L硼砂+40 mmol/L硼酸作為緩沖液。在此條件下，維生素B6的峰形仍較差，出現(xiàn)了平頂峰，不利于分析，當(dāng)向緩沖液中加入一定量十二烷基硫酸鈉(SDS)可顯著改善維生素B6峰形，因此考察了不同濃度SDS對待測物分離度及峰形的影響。結(jié)果顯示，6種化合物的峰形不受SDS濃度的影響，但出峰時間隨SDS濃度的增大而延長，分離度也相應(yīng)增大。當(dāng)SDS終濃度大于20 mmol/L后，苯甲酸鈉與維生素B1的出峰時間均大于20 min。

綜上，考慮分離度及分析時間等因素，最終選擇40 mmol/L硼砂+40 mmol/L硼酸溶液+20 mmol/L SDS(pH 9.0)為分離緩沖液。

2.1.2 分離電壓對分離效果的影響分離電壓越高，分析物的遷移時間越短，因此考察了不同分離電壓(10、15、20、25 kV)的分離效果。結(jié)果顯示，10～25 kV分離電壓下6種化合物的分離效果均良好，但低電壓(10、15 kV)下的分離時間較長，超過20 min;20 kV和25 kV時的分離時間較短，可在10 min內(nèi)出峰，但高電壓下毛細(xì)管中產(chǎn)生的焦耳熱會隨之增加，從而會引起峰形展寬，因此選擇最佳分離電壓為20 kV。

2.1.3 檢測波長的選擇通過6個化合物在200～400 nm范圍內(nèi)全波長掃描圖發(fā)現(xiàn)，維生素B1、B2、B6、煙酰胺在270 nm附近有最大吸收，苯甲酸鈉雖然在225 nm附近有最大吸收，但270 nm處的吸收值也很大，為便于檢測選擇270 nm作為維生素B1、B2、B6、煙酰胺和苯甲酸鈉的檢測波長。泛酸鈣在大于220 nm波長時無紫外吸收，僅在低波長處有末端吸收，因此選擇200 nm為其測定波長。泛酸鈣的出峰時間在9 min左右，因此選擇在8.8～10.0 min時將波長切換為200 nm。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of the mixed solution1.vitamin B2,2.vitamin B6,3.nicotinamide,4.calcium pantothenate,5.sodium benzoate,6.vitamin B1

綜上，優(yōu)化后維生素B1、B2、B6、煙酰胺、苯甲酸鈉、泛酸鈣的電泳條件見“1.3”所述，其電泳圖見圖1，由圖可見，6種組分可在13 min內(nèi)完全分離，分離度較好。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 專屬性試驗五維他口服溶液中的其他輔料成分如橙皮酊、乙醇和枸櫞酸可能會對其6種組分的測定產(chǎn)生干擾，因此實驗按其處方配比稱取相應(yīng)的輔料成分，按照“1.2.3”方法制成陰性空白樣品溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，陰性樣品溶液中其他組分不影響待測組分的測定，方法的專屬性良好。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限分別精密量取“1.2.1”配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化條件下進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣3次，以6個化合物的3次峰面積的平均值(y，AU)對其質(zhì)量濃度(x，mg/L)進(jìn)行線性回歸，以3倍信噪比(S/N=3)計算方法的檢出限(LOD)，以S/N=10計算方法的定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，維生素B1、B2、B6、煙酰胺、苯甲酸鈉、泛酸鈣在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)不低于0.998 9，LOD為0.012～0.250 mg/L，LOQ為0.042～0.830 mg/L(表1)。

表1 6 個化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量下限Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of six compounds

圖2 樣品溶液的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of the sample solution1.vitamin B2,2.vitamin B6,3.nicotinamide,4.calcium pantothenate,5.sodium benzoate,6.vitamin B1

2.2.3 重復(fù)性與穩(wěn)定性取五維他口服溶液(批號：191001)按“1.2.2”方法平行制備6份樣品溶液，在優(yōu)化條件下測定，重復(fù)進(jìn)樣3次并記錄6個待測組分的平均峰面積和遷移時間。結(jié)果顯示，維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣及苯甲酸鈉的峰面積及遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)均小于2.0%，表明方法的重復(fù)性良好。

取五維他口服溶液(批號：191001)按“1.2.2”方法配制樣品溶液，分別在0、2、4、8、16、24、48、72、96、120 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，在24 h內(nèi)6個成分峰面積的RSD均小于2.0%，而放置24 ～120 h后，6個成分峰面積的RSD為4.5%～18%，表明待測組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定，超過24 h后不穩(wěn)定，因此建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.4 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差取批號191001的五維他口服溶液,向其中添加一定量“1.2.1”配制的混合對照品溶液，配成低、中、高3個濃度的加標(biāo)溶液，在優(yōu)化條件下重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄平均峰面積，計算待測組分的回收率與RSD。結(jié)果顯示，維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣及苯甲酸鈉的回收率為97.0%～103%，RSD為0.60%～1.8%，表明方法的準(zhǔn)確度高、精密度好，能夠滿足五維他口服溶液中此6個成分的同時測定要求。

2.3 實際樣品測定

采用本文建立的MEKC方法對來自3個廠家6個不同批次的五維他口服溶液進(jìn)行檢測，每個樣品平行3份，在優(yōu)化條件下測定維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣及苯甲酸鈉的含量(表2)。結(jié)果顯示，6種化合物的測定結(jié)果與標(biāo)示值相差不大，均在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度的90.0%～110%范圍內(nèi)，表明方法準(zhǔn)確性較好，可用于五維他口服溶液的質(zhì)量控制。圖2為批號191001樣品的電泳圖。

表2 實際樣品的測定結(jié)果(n=3)Table 2 Analytical results for the real samples(n=3) ρ/(mg·L-1)

3 結(jié) 論

本文建立了膠束電動色譜法同時測定五維他口服溶液中維生素B1、B2、B6、煙酰胺、泛酸鈣和苯甲酸鈉含量的分析方法，該方法操作簡便可靠，靈敏度高、重復(fù)性好，具有很好的實際應(yīng)用價值，可用于該制劑的質(zhì)量控制。