楊漢波, 韓珊, 何丹, 蔣時(shí)姣, 曹廣黎, 萬雪琴

(長江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長江上游森林資源保育與生態(tài)安全國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華西雨屏區(qū)人工林生態(tài)系統(tǒng)研究長期科研基地，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)研究所，成都，611130)

核桃黑斑病，又名核桃黑腐病，幾乎是世界上所有核桃主要產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的地上部分病害[1-3], 導(dǎo)致落果嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)落果率達(dá)60%以上，開花前后發(fā)生的感染可以使產(chǎn)量損失達(dá)到80%[4-6]。核桃細(xì)菌性黑斑病病原菌是專化寄生胡桃屬(Juglans)病原細(xì)菌[7-8]。我國有關(guān)核桃黑斑病菌大都命名為Xanthomonas camperstrispv. juglandis，后來又被命名為X. arboricolapv. juglandis，也有部分報(bào)道為X.juglandis[6,9-10]。陳善義等[11]對北京地區(qū)核桃黑斑病病原菌16S rDNA序列進(jìn)行分析，認(rèn)為其病原菌為X. campestris。美國加州核桃細(xì)菌性黑斑病菌株的dnaK和rpoD基因分析表明，致病菌的基因序列與X. arboricola非常接近，rDNA基因分析結(jié)果表明與X. arboricola、X. gardneri和X. vesicatoriajie均接近[12]。Stefania等[13]采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對法國、英國和意大利等8個(gè)國家的66個(gè)核桃黑斑病致病菌鑒定為X. arboricolapv. pruni、X. arboricolapv. corylina、X. campestrispv. campestris、X. fragariae、X. hortorum和X. axonopodispv. vesicatoria。

目前，任何核桃品種(無性系)對黑斑病都不具有完全免疫[14]。采用化學(xué)防治，存在無法掌握殺菌劑最佳使用時(shí)間及其對環(huán)境和自然生態(tài)系統(tǒng)的影響等問題，因此，使用抗病育種方法獲得抗性栽培品種仍是最為有效和可靠的核桃黑斑病防治方法[1,15-16]。Soltani等[17]對16個(gè)核桃基因型接種病原菌X. arboricolapv. juglandis進(jìn)行抗病性試驗(yàn)，篩選出最抗病基因型94和最感病基因型69。Botu等通過對550個(gè)英國核桃無性系進(jìn)行田間測試和形態(tài)學(xué)特征，篩選出3個(gè)(Valcor、Valmit和Valrex)抗黑斑病的無性系[18]。我國西南地區(qū)核桃產(chǎn)區(qū)高濕高熱環(huán)境為病原菌的侵染提供了良好的先決條件，加之引進(jìn)的北方品種展葉較早，黑斑病十分普遍并持續(xù)發(fā)生，已成為影響該地區(qū)核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素[19]。本研究對引起四川盆地地區(qū)核桃黑斑病的病原體進(jìn)行分離和致病性測定，依據(jù)病原菌形態(tài)學(xué),并結(jié)合16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原菌的種類；同時(shí)，通過田間人工接種分離的病原物，對收集的四川18個(gè)核桃栽培品種(無性系)進(jìn)行抗病性鑒定，以期為核桃黑斑病的準(zhǔn)確識別、抗病機(jī)理研究和抗病新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

用于抗性評價(jià)的18個(gè)核桃(Juglans regia)栽培品種(無性系)信息見表1, 均保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地(103°67′ E，30°63′ N)，基地位于四川省崇州市, 屬典型亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，年均溫15.9℃, 年均日照時(shí)數(shù)1 161.5 h，年均降雨量1 000 mm以上，且主要集中在夏季，試驗(yàn)地能充分代表四川盆地的氣候特點(diǎn)。

表1 用于抗病評價(jià)的核桃品種(無性系)Table 1 Cultivars (clones) used for resistance evaluation

用于病原菌分離的寄主材料取自四川盆地地區(qū)核桃林，采集表現(xiàn)出黑斑病癥狀的當(dāng)年生幼嫩葉片、幼果共計(jì)36份，用濕紗布擦洗干凈放入自封袋中，做好標(biāo)記并裝入冰袋帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-20℃冰箱中備用。2 a生健康核桃苗用于回接試驗(yàn)，進(jìn)行致病性測定。

1.2 病原菌的分離純化與回接試驗(yàn)

對采集的試驗(yàn)材料進(jìn)行拍照、整理和編號，然后對疑似黑斑病的葉片、幼果進(jìn)行病原菌的分離和純化。用平板劃線法分離病原菌[20]：將具有典型癥狀的核桃病葉用無菌水清洗干凈，自然晾干后剪成10個(gè)5 mm×5 mm的小塊病組織；75%酒精浸泡5 s,立即用無菌水清洗3次；放入0.1%的升汞溶液中浸泡1 min，無菌水清洗3次；將病葉組織置于滅菌的載玻片上，滴加無菌水，并用滅菌的玻璃棒充分研碎；用滅菌移植環(huán)蘸取研碎的組織液于NA平板上劃線培養(yǎng)，每份材料重復(fù)3次；最后將平板翻轉(zhuǎn)并做好標(biāo)記，將其置于28℃、12 h/12 h光暗交替的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將分離得到的病原菌放到LB平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后的菌落轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，-80℃保存?zhèn)溆肹21]。

采用針刺涂抹法和柯赫氏法則進(jìn)行回接試驗(yàn)。將保存的菌株劃線轉(zhuǎn)移至LB平板，28℃活化培養(yǎng)3~4 d，然后挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，配制成108CFU/mL的菌體懸浮液。選取健康的2 a生核桃苗，采取針刺涂抹法于葉背面接種(先用滅菌束針輕刺葉片，再用毛筆刷蘸取少量菌液，涂抹于葉背面進(jìn)行接種)，接種后覆上一層保鮮膜，保濕培養(yǎng)24 h后去掉保鮮膜，并設(shè)置空白LB液體接種葉片作為對照。每處理接種6片葉，重復(fù)3次。7~10 d后記錄發(fā)病情況，根據(jù)柯赫氏法則，待病原菌接種部位表現(xiàn)典型的黑斑病癥狀時(shí)，對發(fā)病的組織重新進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，并觀察分離出的病原菌形態(tài)特性是否與之前的相同，初步確定核桃黑斑病的病原菌，再根據(jù)其發(fā)病率和嚴(yán)重度確定病原細(xì)菌的致病力大小。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將黑斑病病原菌活化培養(yǎng)于LB平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3 d后在OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)特征，包括菌落表面(顏色、形狀、大小、質(zhì)地和光澤度)、是否隆起、邊緣和透明度等重要的鑒別特征。

1.4 病原菌分子鑒定

利用天根細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取代表菌株28-2基因組DNA，稀釋10倍備用。以DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F/1492R (正向: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25μL：DNA模板1μL，Taq聚合酶(2×) 12.5μL,正反向引物各1μL，去離子水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，然后將菌株28-2的PCR產(chǎn)物送上海擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行16S rDNA測序。

將測序獲得的序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，并于GenBank已登錄的相似序列進(jìn)行同源性比對，利用MEGA X軟件采用鄰接法(neighborjoining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系。將病原菌的親緣關(guān)系分析結(jié)果與其形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀及致病性結(jié)合起來對其進(jìn)行鑒定。

1.5 抗病性評價(jià)

將菌株28-2活化后配置107CFU/mL菌體懸浮液。選取健康且長勢一致的核桃品種(無性系)各13株，10株用于接種，3株為對照，從外圍枝的頂葉上選取從外往里數(shù)長勢良好的第二對小葉(12片/株),并做好標(biāo)記，采用針刺涂抹法接種，接種植株均為1 a生嫁接苗。以接種無病原菌的LB液為對照。接種后覆層保鮮膜，保濕培養(yǎng)48 h后揭除，10 d之后統(tǒng)計(jì)每株葉片的發(fā)病情況。

調(diào)查品種(無性系)的發(fā)病率(%)=發(fā)病的點(diǎn)數(shù)/調(diào)查總點(diǎn)數(shù)×100%，采用十字交叉法測量黑斑病的病斑直徑，并進(jìn)行分級[22], I級病斑癥狀不明顯甚至無癥狀；II級病斑直徑≥2.0 mm；III級病斑直徑2.1~4.0 mm；IV級病斑直徑4.1~6.0 mm；V級病斑直徑≥6.1 mm。參照盛寶龍等[23]的方法計(jì)算病情指數(shù)(%)=∑(病點(diǎn)數(shù)×病級)/(調(diào)查總點(diǎn)數(shù)×最高病級)×100%，并將核桃品種(無性系)對黑斑病的田間抗性分為4級：高抗(HR)的病情指數(shù)為0.00~24.00，抗病(R)的病情指數(shù)為24.01~31.00，感病(S)的病情指數(shù)為31.01~40.00，高感(HS)的病情指數(shù)≥40.01。

2 結(jié)果和分析

2.1 病原菌的分離、純化和致病性測定

對從四川各地采集的36份核桃病葉、病果進(jìn)行病原菌分離純化，獲得單菌落的菌株18株，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，主要分為4類：黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、泛菌屬(Pantoea)和金黃桿菌屬(Chryseobacterium)，分離率分別為黃單胞桿菌屬(33.33%)>短小桿菌屬(27.78%)>泛菌屬(22.22%)>金黃桿菌屬(16.67%)。從葉片分離的菌落較純, 且分離率較高，而從果實(shí)上分離的菌落比較雜亂, 說明核桃果實(shí)更容易受到多種病菌的復(fù)合侵染。對分離的4類菌株進(jìn)行回接試驗(yàn)，接種7 d后, 只觀察到黃單胞菌屬菌株能引起植株發(fā)病。分離回接試驗(yàn)感病組織病原菌，其菌落形態(tài)與原分離的病原菌菌落形態(tài)相一致，確定該病菌與病樣分離獲得的病原菌為同一病菌, 符合柯赫氏法則，說明黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)是四川盆地核桃黑斑病的病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)特征及分子鑒定

篩選獲得的6個(gè)黃單胞桿菌屬菌株形態(tài)特征基本相同，均表現(xiàn)為圓形、光滑、隆起，前期顏色為乳白色，后期均發(fā)展為淺黃色，質(zhì)地均較粘稠(圖1: A)。顯微鏡下觀察，6個(gè)菌株的單個(gè)菌體均呈短桿狀，菌體大小為(0.3~0.8)μm×(1.0~2.4)μm, 革蘭氏染色反應(yīng)為陰性(圖1: B)。將分離獲得的菌株回接到健康2 a生核桃植株葉片上，均能產(chǎn)生典型的黑斑病病斑。再次分離并挑取單菌落純化，經(jīng)組織培養(yǎng)和菌體形態(tài)學(xué)觀察比較，再分離的病原菌與最初用于接種分離的菌株無差異，說明致病菌與接種菌為同一種菌，符合柯赫氏法則。

從分離的菌株中選取代表病原菌株28-2進(jìn)行基因組DNA提取，以提取的基因組DNA為模板，使用通用引物27F/1492R擴(kuò)增得到長度約為1 446 bp的16S rDNA片段(圖2: A)。將獲得的16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果表明，其與樹生黃單胞桿菌(Xanthomonas arboricola) (登錄號：KP340804.1)的相似性高達(dá)99%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明菌株28-2與黃單胞桿菌的親緣關(guān)系最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支(圖2: B)。因此，結(jié)合致病性測定的結(jié)果、病原菌形態(tài)學(xué)特征和序列分析，將菌株28-2鑒定為樹生黃單胞桿菌，初步確定四川盆地地區(qū)核桃細(xì)菌性黑斑病的病原菌為樹生黃單胞桿菌。

2.3 抗病性評價(jià)

圖2 菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖和基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 PCR amplification of 16S rDNA, and phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

接種后，所有測試品種(無性系)的葉片均不同程度感病，接種后2~3 d開始出現(xiàn)小病斑，第7天病斑大量出現(xiàn)，但整體發(fā)病程度較輕(圖3: A)。因此，本次田間抗性調(diào)查在接種后的第10天進(jìn)行。供試的18個(gè)核桃品種(無性系)中未發(fā)現(xiàn)對黑斑病免疫的品種，均不同程度發(fā)病，發(fā)病率為35.07%(Shujiang1)~78.57% (Yanyuanzao)，變異系數(shù)為17.62%，其中14個(gè)品種(無性系)發(fā)病率在50.00%以上(圖3: B)。病情指數(shù)為0.18% (Shujiang1)~0.24% (Yanyuanzao)，變異系數(shù)為0.29%，變化趨勢與發(fā)病率基本一致(圖3: C)。根據(jù)抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),篩選出抗病品種(無性系)共10個(gè)(5個(gè)HR品種、5個(gè)R品種)，其中本地優(yōu)良無性系6個(gè)，占抗病品種的60.00%；感病品種(無性系)中，栽培品種占5個(gè)(4個(gè)S品種，1個(gè)HS品種)，占感病品種(無性系)的62.50%，說明本地優(yōu)良無性系總體的抗性要強(qiáng)于栽培品種。

圖3 田間植株葉片侵染情況和品種抗病評價(jià)Fig. 3 Leaf infections in field and resistance evaluation of walnut cultivars (clones)

3 結(jié)論和討論

我國對核桃細(xì)菌性黑斑病的相關(guān)研究主要集中在病害診斷、預(yù)測與防治等方面[6]。為進(jìn)一步明確我國核桃黑斑病病原菌分類地位，本文對引起四川盆地地區(qū)核桃黑斑病的病原菌進(jìn)行分離和鑒定,并通過柯赫氏法則驗(yàn)證分離病原菌的致病性，為從形態(tài)和分子上進(jìn)行病原菌鑒定和分類提供了數(shù)據(jù)。同時(shí)采用田間接種評價(jià)方法，對四川省18個(gè)核桃栽培品種(無性系)進(jìn)行抗病性評價(jià)。

本研究對黑斑病病原菌的形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，此病原菌的菌落、菌體等形態(tài)和培養(yǎng)特征與已報(bào)道的核桃細(xì)菌性黑斑病病原菌黃單胞菌屬細(xì)菌相似[11,24-25]。本試驗(yàn)通過病原菌的形態(tài)學(xué)觀察不能將其鑒定到黃單胞菌屬中具體的種，因此，需要通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。而關(guān)于核桃黑斑病病原菌的命名存在爭議，最早官方公認(rèn)名稱為X. campestrispv. juglandis (Pierce) Vauterin, 后命名為X. arboricolapv. juglandis (Pierce) Vauterin，最近有提議更名為X. juglandis(Pierce) Dowson[10,26-27]。Adaskaveg等根據(jù)dnaK、rpoD和rDNA基因分析,認(rèn)為美國加州核桃細(xì)菌性黑斑病致病菌與X. Arboricola、X. gardneri和X. vesicatoriajie接近。Daiva等[28]通過fyuA、gyrB和rpoD基因序列分析，認(rèn)為立陶宛和波蘭區(qū)核桃黑斑病病原菌為X. arboricolapv. juglandis。陳善義等[11]報(bào)道北京郊區(qū)核桃黑斑病病原菌的16S rDNA序列與X. campestris和X. arboricola的某些變種相似性為99%, 但具體病原菌的鑒定還需進(jìn)一步研究。王瀚等[25]采用形態(tài)學(xué)鑒定和16S rDNA序列分析，將甘肅隴南核桃黑斑病病原菌鑒定為X. campestris。曲文文[29]采用形態(tài)鑒定和ITS序列分析，將山東省核桃黑斑病病原菌鑒定為X.arboricola。因此，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法能夠?qū)χ虏〔≡M(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。為此, 本研究根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹, 對病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明病原菌的16S rDNA基因序列與已登錄的X. arboricola(登錄號: KP340804.1)親緣關(guān)系最近，相似性高達(dá)99%。結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征，本研究將四川盆地地區(qū)核桃黑斑病病原菌鑒定為變形菌門(Proteobacteria)假單胞菌科(Pseudomonadaceae)樹生黃單胞菌屬細(xì)菌X. arboricola。四川省2000-2008年栽培核桃主要為北方引進(jìn)品種,這可能是四川盆地區(qū)與山東省核桃黑斑病為同一致病病原菌的原因之一。同時(shí)，與其他地區(qū)核桃黑斑病病原菌種存在差異，也表明我國不同生態(tài)環(huán)境下引起核桃黑斑病病原菌的多樣性，對探索核桃細(xì)菌性黑斑病的發(fā)病規(guī)律、準(zhǔn)確識別和有效防治技術(shù)研究具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

四川省近年來實(shí)施退耕還林，為促進(jìn)山區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展，大范圍推廣核桃栽培，并從其它核桃主產(chǎn)區(qū)調(diào)運(yùn)苗木，但由于四川高濕熱的環(huán)境條件，引進(jìn)的北方早實(shí)核桃受到黑斑病害困擾造成大面積減產(chǎn)或死亡及品質(zhì)的下降，已成為影響四川核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素[19]。近年來，隨著一大批本地選育優(yōu)良核桃種質(zhì)在生產(chǎn)中的使用，對四川核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展起到一定的促進(jìn)作用[30]。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)四川盆地區(qū)本地核桃種質(zhì)材料發(fā)病率較低，說明本地優(yōu)良的核桃種質(zhì)材料可能對核桃黑斑病有一定的抗性。因此，本研究采用田間接種的方法對四川栽培品種和收集的本地優(yōu)良無性系進(jìn)行黑斑病抗性評價(jià)，其中Shujiang1、Qingxiang、Panhe1、91和86號被評價(jià)為高抗品種，病情指數(shù)為17.71%~23.88%；Yanyuanzao和200號為高感病品種，病情指數(shù)分別為51.96%和40.10%。這些被病原菌感染但表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性的表型在育種中被認(rèn)為可能獲得持久和廣泛的抗性，這些材料可作為進(jìn)一步抗病品種選育的優(yōu)良材料[31]。Jiang等[32]采用田間調(diào)查法、室內(nèi)離體葉片接種法進(jìn)行核桃黑斑病抗性調(diào)查，結(jié)果表明，Shujiang1屬于易感病品種，與本研究結(jié)果不一致，可能原因一是試驗(yàn)材料的差異，本試驗(yàn)材料為1 a生嫁接苗，而Jiang等采用的8 a生結(jié)果樹，葉片結(jié)構(gòu)的差異可能導(dǎo)致抗病性結(jié)果出現(xiàn)偏差；二是病原菌接種方法不同可能導(dǎo)致病原菌侵染能力的差異；三是環(huán)境條件不同也可能導(dǎo)致病原菌致病性的不同。在病害最流行時(shí)期和植株最易感病時(shí)期進(jìn)行感病情況調(diào)查，能夠較真實(shí)地反映材料的抗性水平。因此，可采用田間調(diào)查和田間接種相結(jié)合的方法對核桃黑斑病抗病性進(jìn)行準(zhǔn)確評價(jià)，為抗病品種(無性系)的初步篩選和后續(xù)的抗病相關(guān)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。