趙聰慧, 俞振明, 何春梅, 王浩斌, 司燦, 張明澤, 段俊*

(1. 中國科學(xué)院華南植物園, 中國科學(xué)院核心植物園, 廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點實驗室, 廣州 510650; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

石斛屬(Dendrobium)隸屬蘭科(Orchidaceae)樹蘭亞科(Epidendroideae)，是蘭科最大的屬之一，具有極高的觀賞價值，因其花香奇特、花朵秀麗、花形迷人與色澤鮮艷享譽世界，被稱為世界“四大觀賞洋蘭”之一[1-2]。鐵皮石斛(D. officinale)是珍稀的藥食同源傳統(tǒng)貴細中藥材，主要以干燥莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津、抗氧化、抗衰老、增強免疫力等功效[3]，是石斛屬中最為珍稀名貴的品種。對石斛屬植物的化學(xué)研究主要集中在莖、葉的多糖、石斛堿、黃酮等成分上[4-5]，而對于石斛花的研究較少。

鐵皮石斛花為可食用部分，產(chǎn)量豐富，具有很大的資源開發(fā)空間，在民間被廣泛加工成花茶飲用?；ㄏ闶怯^賞植物重要的審美和商品性狀之一，作為信號物質(zhì)，具有招引昆蟲授粉等重要生態(tài)功能[6]。石斛屬植物花香的研究報道較少，鐵皮石斛的花香物質(zhì)以萜類、脂肪族、芳香族化合物為主,尤其是蒎烯、檸檬烯、桉油素、芳樟醇、α-松油醇等單萜化合物[7]。鼓槌石斛的主要花香物質(zhì)是α-蒎烯、β-羅勒烯、苯乙醛和乙酸辛酯[8]。鐵皮石斛花中富含多糖、揮發(fā)油、多酚類、花色素和黃酮類物質(zhì)[7,9-11]，與莖、葉相比，花中總黃酮、總酚類物質(zhì)含量更高，具有較高的抗氧化活性，而且還富含精氨酸等人體必需的氨基酸[10,12]。然而，關(guān)于石斛屬植物花中化合物合成的分子機理還不清楚，參與其合成的相關(guān)基因也鮮有報道[13-14]。因此，亟需開展花中化合物成分分析、生物合成途徑及關(guān)鍵物質(zhì)合成的分子機制研究，以便更好地開發(fā)利用石斛花資源。

高質(zhì)量、高純度RNA提取是植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，如Real-Time PCR分析、Northern雜交分析、目的基因克隆、cDNA文庫構(gòu)建等都需要高質(zhì)量的RNA。常用的植物總RNA提取方法有TRIZOL法[15]、CTAB法[16]、SDS法[17]、異硫氰酸胍法[18]和試劑盒法[19]等。目前，以上方法均已應(yīng)用于鐵皮石斛莖的總RNA提取[10-11]，但是不同植物或同種植物不同組織所含的成分存在較大差異，鐵皮石斛花的總RNA提取方法必須通過實驗才能確定。

因此，本研究針對鐵皮石斛花中黃酮、多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)含量高的特點，通過比較改良CTAB-LiCl法、改良CTAB-異丙醇法、改良SDS-LiCl法、改良SDS-異丙醇法以及試劑盒法等8種方法提取的總RNA質(zhì)量，篩選并確定鐵皮石斛花的總RNA提取方法，為鐵皮石斛花香物質(zhì)合成酶基因的表達、調(diào)控及其相關(guān)的分子生物學(xué)研究提供技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的5種石斛屬植物花朵均采自廣東省廣州市中國科學(xué)院華南植物園石斛育種基地(25.14°N，113.35° E)，包括氣味略輕顏色淡黃的鐵皮石斛(Dendrobium officinale，圖1)、香氣濃郁色彩明黃的鼓槌石斛(D. chrysotoxum)、花呈淡黃綠色的霍山石斛(D. huoshanense)、氣味芬芳顏色明艷的金釵石斛(D.nobile)和美花石斛(D. loddigesii)，于盛花期(2019年4-5月)的晴天上午11:00每個品種隨機采摘10朵以上，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和試劑

十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane, THAM]、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)、十六烷基三乙基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，多糖多酚植物RNA提取試劑盒(貨號：0416-50)購自北京華越洋生物科技有限公司，柱式植物RNAout 2.0試劑盒(貨號: 90404-50)購自北京天恩澤基因科技有限公司, RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(貨號：DP441)購自天根生化科技有限公司，Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(貨號：BSC65S1)購自杭州博日科技有限公司，RNA提取酚試劑(貨號：W0250)購自北京索萊寶科技有限公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：M1701)購自美國Promega公司，鐵皮石斛Actin基因引物由北京擎科生物科技公司合成, 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone 40, PVP-40)、無水乙醇、三氯甲烷、β-巰基乙醇、異丙醇、氯化鈉等化學(xué)試劑均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

試驗所用試劑瓶、研缽、鑷子、藥匙等非塑料制品在180℃下烘烤8 h后使用，塑料制品及試劑經(jīng)0.1% (W/V) DEPC水處理12 h，121℃高壓滅菌30 min后，烘干備用。

1.3 花的總RNA提取方法

研究共采用了8種提取方法：改良CTAB-LiCl法(M1)、改良CTAB-異丙醇法(M2)、改良SDS-LiCl法(M3)、改良SDS-異丙醇法(M4)、多糖多酚植物RNA提取試劑盒法(M5)、柱式植物RNAout 2.0試劑盒法(M6)、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M7)、Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M8)。

改良CTAB-LiCl法(M1)參照Zeng等[20]的方法并適當(dāng)修改。稱取500 mg新鮮花朵，在液氮中快速研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，加入1 mL 65℃預(yù)熱的CTAB裂解液[2% CTAB (W/V), 2 mol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA (pH=8.0), 100 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0), 2%β-巰基乙醇(使用前加入)]，65℃水浴15 min，期間上下顛倒3~5次。加入900μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,V/V), 劇烈振蕩30 s,于4℃下12 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入800μL氯仿/異戊醇(24∶1,V/V),劇烈振蕩30 s，于4℃下12 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入1/4體積的10 mol/L LiCl，于4℃冰箱中靜置過夜，于4℃下12 000×g離心30 min沉淀RNA，棄上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，于4℃下12 000×g離心5 min，棄上清，風(fēng)干后，加入40μL DEPC水溶解RNA，于-80℃冰箱保存。

改良CTAB-異丙醇法(M2)參照張力鵬等[21]的方法并適當(dāng)修改。稱取500 mg新鮮的鐵皮石斛花朵，液氮中研磨成粉末后迅速轉(zhuǎn)入含有500μL CTAB提取液[2% CTAB (W/V), 2% PVP-40 (W/V),0.045%亞精胺(W/V), 2.5 mol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA (pH=8.0), 100 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0), 2%β-巰基乙醇(使用前加入)]中，65℃水浴5 min，加入250μL氯仿，劇烈震蕩，于4℃下13 000×g離心5 min, 取上清液加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1,V/V)，劇烈振蕩，于4℃下13 000×g離心5 min, 取上清液加入等體積的異丙醇，溫和混勻后，-40℃冰箱放置30 min，于4℃下13 000×g離心10 min,RNA沉淀漂洗方法與M1相同。

改良SDS-LiCl法(M3) 參照Liu等[22]的方法并適當(dāng)修改。稱取100 mg新鮮的鐵皮石斛花朵，加液氮充分研磨，加入RNA提取緩沖液[1% SDS (W/V),4% PVP-40 (W/V), 250 mmol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA (pH=8.0), 50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)]，迅速混勻后室溫放置5 min，于4℃下12 000×g離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入700μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,V/V)，溫和混勻后, 于4℃下12 000×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入600μL氯仿/異戊醇(24∶1,V/V),劇烈振蕩30 s，于4℃下12 000×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入500μL 10 mol/L LiCl，冰上放置60 min，于4℃下12 000×g離心10 min，RNA沉淀漂洗方法與M1相同。

改良SDS-異丙醇法(M4)參照Cheng等[17]的方法并適當(dāng)修改。稱取100 mg新鮮的鐵皮石斛花朵，液氮中研磨成粉末后迅速轉(zhuǎn)入含有1 mL 65℃預(yù)熱的SDS提取液[10% SDS (W/V), 1 mol/L NaCl, 2.5 mol/L Tris-HCl (pH=7.4), 100 mmol/L EDTA (pH=8.0), 4%β-巰基乙醇(使用前加入)]中,充分渦旋混勻，65℃水浴20 min，期間上下顛倒3~5次, 于4℃下13 000×g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1/2體積的RNA提取酚試劑，充分顛倒混勻，-20℃冰箱放置10 min，于4℃下13 000×g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1,V/V), 顛倒混勻，于4℃下13 000×g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇,-20℃放置30 min，于4℃下13 000×g離心30 min，RNA沉淀漂洗方法與M1相同。

多糖多酚植物RNA提取試劑盒法(M5)、柱式植物RNAout 2.0試劑盒法(M6)、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M7)、Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M8)均按照說明書要求進行。

1.4 RNA質(zhì)量濃度檢測

提取的RNA采用Nano DropTM2000c核酸蛋白分析儀(Thermo Scientific公司)進行測定，樣品檢測量為1μL，記錄樣品的A260nm/A280nm和A260nm/A230nm值和濃度，并計算RNA產(chǎn)率(μg/g)=RNA濃度(μg/μL)×稀釋倍數(shù)×RNA樣品體積(μL)/樣品質(zhì)量(mg)。RNA條帶完整性使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 4.5μL樣品與0.5μL 10×Loading Buffer (TaKaRa公司)混勻后點樣，180 V電壓電泳10 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶并拍照。

1.5 RT-PCR檢測

將M4和M5方法提取的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以該cDNA為模板，以鐵皮石斛Actin(NCBI登錄號：JX294908)[23]為內(nèi)參基因進行擴增。正向引物：5′-ATATGCTAGTGGCCGCACAA-3′; 反向引物：5′-GCGGCTTCCATTCCAATCAG-3′。25μL PCR反應(yīng)體系為：Yeasen PCR Master Mix 12.5μL，正向引物1μL,反向引物1μL，cDNA 1μL，ddH2O 9.5μL。擴增程序為：94℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取4.5μL PCR產(chǎn)物，加入與0.5μL 10×Loading Buffer混勻后上樣, 于1%瓊脂糖凝膠儀上150 V電壓電泳15 min, 用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.6 其他石斛屬植物總RNA提取

采用M4和M5方法分別提取霍山石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、美花石斛花朵的總RNA，檢測完整性、純度和濃度。

2 結(jié)果和分析

2.1 總RNA完整性檢測

凝膠電泳是一種簡便、適用的鑒定評估RNA完整性的方法，通過凝膠圖像可判斷RNA有無降解以及降解程度。從圖2可見，采用1%瓊脂糖凝膠電泳，M8未見明顯條帶，效果不佳；M3、M6和M7提取的RNA條帶較弱，濃度低，可能在提取或者電泳過程中RNA發(fā)生了部分降解；其余提取方法均顯示出較為明顯的條帶，其中M1提取的RNA條帶亮度較高，但條帶較為彌散不清晰且具有拖帶現(xiàn)象，存在蛋白和多糖污染情況，可能由于樣品中多糖多酚含量較高，提取液中CTAB未能將其全部聚合形成復(fù)合物沉淀從而未與核酸更好地分離；M2和M4方法條帶較為清晰，盡管M2提取的RNA中28S和18S條帶明暗差距更為明顯，但是M4提取的RNA中28S條帶亮度明顯高于18S；M5方法條帶清楚且無拖帶，重復(fù)性也較好。因此，比較8種提取方法，M4、M5提取的RNA完整性較好。

2.2 總RNA濃度與純度的檢測

高質(zhì)量RNA的A260nm/A280nm應(yīng)介于1.8~2.0之間，A260nm/A230nm應(yīng)大于2.0。通過Nano Drop 2000核酸蛋白檢測儀對8種方法提取鐵皮石斛花的總RNA進行濃度和純度檢測(表1), M4方法所得的總RNA濃度最高，為(199.31±5.68) ng/μL；M5的次之[(142.30±4.66) ng/μL]；M2、M3、M6、M7的為(46.42±4.84)~(66.37±2.47) ng/μL，效果一般；M8的僅為(16.20±1.23) ng/μL，無法滿足后續(xù)試驗要求。除M2、M6、M8提取的總RNA的A260nm/A280nm不符合要求外，其余方法均在1.8~2.0之間，M1、M6提取的總RNA的A260nm/A230nm低于2.0，其余方法的均高于2.0，說明樣品中來自蛋白、酚類、糖類等的污染較少，提取的RNA質(zhì)量較為可靠。因此，M4和M5是最優(yōu)的2種方法。

2.3 內(nèi)參基因的RT-PCR擴增

圖2 8種方法提取鐵皮石斛花朵總RNA的電泳圖。M: DNA marker; M1: 改良CTAB-LiCl法; M2: 改良CTAB-異丙醇法; M3: 改良SDS-LiCl法; M4:改良SDS-異丙醇法; M5: 多糖多酚植物RNA提取試劑盒法; M6: 柱式植物RNAout 2.0試劑盒法; M7: RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法; M8: Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法。Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted by eight different protocols from Dendrobium officinale flowers. M: DL2000 marker; M1: Improved CTAB-LiCl method; M2: Improved CTAB-isopropanol method; M3: Improved SDS-LiCl method; M4: Improved SDS-isopropanol method; M5: Quick RNA Isolation Kit; M6: Column Plant RNAout 2.0; M7: RNAprep Pure Plant Plus Kit; M8: Plant Total RNA Extraction Kit.

表1 8種方法提取的鐵皮石斛花RNA的濃度、純度和產(chǎn)率Table 1 Yield, purity and concentration of total RNA extracted by using eight different protocols from Dendrobium officinale flowers

為進一步驗證所提取RNA的完整性，使用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒, 將M4、M5方法提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA第一條鏈為模板設(shè)計鐵皮石斛內(nèi)參基因Actin (NCBI登錄號:JX294908)的特異性引物進行擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3), 可見，兩種方法提取的RNA, 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后PCR擴增產(chǎn)物片段均為250~500 bp，與預(yù)期目的片段390 bp相符，且條帶清晰、單一，亮度較高，說明SDS-異丙醇法(M4)和華越洋試劑盒法(M5)均能用于RT-PCR反應(yīng)等以RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)研究分析。

2.4 石斛屬植物RNA的提取

圖3 鐵皮石斛Actin基因的RT-PCR電泳圖。M: DNA marker; M4: 改良SDS-異丙醇法; M5: 多糖多酚植物RNA提取試劑盒法。Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of Actin gene from Dendrobium officinale.M: DL2000 marker; M4: Improved SDS-isopropanol method; M5: Quick RNA Isolation Kit.

采用M4和M5對4種常見的石斛屬植物(霍山石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、美花石斛)進行總RNA提取(圖4)。兩種方法提取的RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳均得到清晰無彌散的條帶，說明蛋白質(zhì)、酚類、糖類等雜質(zhì)去除效果較好，所得RNA的A260nm/A280nm介于1.8~2.0之間，A260nm/A230nm大于2.0，且RNA濃度均高于100 ng/μL。因此, M4和M5方法能夠提取出高質(zhì)量、符合要求的霍山石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、美花石斛花中的總RNA，也可為蘭科石斛屬其他植物花的RNA提取提供參考。

圖4 4種石斛屬植物花的總RNA電泳圖。A: M4; B: M5; M: DNA marker; 1: 鼓槌石斛; 2: 霍山石斛; 3: 金釵石斛; 4: 美花石斛。Fig. 4 Gel electrophoresis of flower total RNA from four Dendrobium plants. A: M4; B: M5; 1: D. chrysotoxum; 2: D. huoshanense; 3: D. nobile; 4: D.loddigesii.

3 結(jié)論和討論

無論是關(guān)鍵基因克隆、Real-Time PCR分析, 還是高通量測序等分子生物學(xué)研究，獲取純度高、完整性好、濃度高的RNA是研究開展的前提。石斛屬植物花朵在生長過程中會大量富集揮發(fā)油、多酚類、花色素和黃酮類等多種次生代謝產(chǎn)物以及蛋白質(zhì)和多糖等有機大分子[7-12,14]。其中，多酚類物質(zhì)易氧化成醌，與RNA發(fā)生不可逆結(jié)合，在有機溶劑抽提過程中會與部分RNA結(jié)合而流失[20,22]，影響RNA提取產(chǎn)率。多糖與RNA的理化性質(zhì)相似,在沉淀RNA過程中易形成黏膠狀沉淀，導(dǎo)致所得RNA難溶于水，或溶解后溶液粘稠[17,20-22]，RNA產(chǎn)率降低，此外，多糖可以抑制下游酶的反應(yīng)活性[17-18]，被污染的RNA難以進行后續(xù)的分子生物學(xué)研究。因此，在石斛屬植物(鐵皮石斛)花朵的總RNA提取過程中，有效去除DNA、蛋白質(zhì)和多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物干擾，抑制RNA酶活性是提取純度高、完整性好、濃度大RNA的關(guān)鍵所在。

本研究采用改良SDS-異丙醇法(M4)以SDS、高濃度NaCl和β-巰基乙醇作為RNA抽提液的主要成分，經(jīng)過水飽和酚、氯仿/異戊醇抽提，將絕大多數(shù)多糖、酚類物質(zhì)留在有機相，再經(jīng)異丙醇低溫孵育，從而獲得完整性好、純度高的RNA。其中，SDS是一種陰離子表面活性劑，使蛋白質(zhì)變性，細胞膜裂解，讓核酸溶解于裂解液中，與β-巰基乙醇共同作用抑制RNA酶和DNA酶活性[17,24]。水飽和酚使蛋白質(zhì)變性，也抑制了RNA酶的降解作用。氯仿抽提加速水相與有機相分層，去除核酸溶液中的跡量酚[15,22]。相比較M3，M4提取鐵皮石斛花朵的RNA濃度、純度都較高，主要原因可能是LiCl在與RNA反應(yīng)的同時，也可能與多糖、多酚類物質(zhì)結(jié)合沉淀，導(dǎo)致RNA部分流失。

前人研究表明，試劑盒具操作簡便、提取時間短的優(yōu)勢，可用于多糖多酚含量高的植物總RNA提取。M5對菊花根尖[25]和花瓣[26]、M6對鐵皮石斛莖和葉[23]的總RNA提取效果較好。本研究比較了4種試劑盒(M5、M6、M7、M8)提取鐵皮石斛花總RNA的效果，僅M5可獲得完整性好、純度高的RNA。M6、M7、M8提取的效果較差，這可能是因為鐵皮石斛花富含多糖、黃酮、多酚等物質(zhì),在RNA提取過程中通過濾膜難于將雜質(zhì)與核酸分離，易使小分子RNA丟失，導(dǎo)致總RNA濃度降低。此外，M5提取鐵皮石斛花RNA的過程中，適當(dāng)延長孵育時間可以增加RNA裂解液與植物細胞接觸,促進細胞充分裂解、釋放RNA。

綜上所述，改良SDS-異丙醇法(M4)、多糖多酚植物RNA提取試劑盒(M5)能有效從石斛屬植物(鐵皮石斛、鼓槌石斛、霍山石斛、金釵石斛、美花石斛)花朵中提取純度較高、完整性較好的RNA, 所提取的總RNA的A260nm/A280nm為1.8~2.0，A260nm/A230nm大于2.0，電泳的28S、18S條帶清晰。Realtime PCR結(jié)果表明，M4和M5提取的總RNA純化后可用于鐵皮石斛花香合成的關(guān)鍵酶基因克隆等后續(xù)的分子生物學(xué)試驗。本研究結(jié)果可為富含多糖、黃酮、花色素、多酚類物質(zhì)的其他植物材料的RNA提取提供參考。