秦春芝

摘 ?要：傳染性喉氣管炎（ILT）是家禽重要的呼吸道疾病，主要危害成年雞和產(chǎn)蛋雞。但是，自2019年4月以來，在山東省多個(gè)地區(qū)發(fā)生多起商品肉雞、地方品種肉雞等感染該病并致病現(xiàn)象。臨床主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的呼吸困難、喘鳴、打噴嚏和伸頸呼吸，嚴(yán)重的咳出帶血的分泌物，呼吸道粘膜出血和充血。經(jīng)絨毛尿囊膜接種10日齡SPF雞胚，5 d后可產(chǎn)生典型的絨毛尿囊膜病變。參考GenBank中傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）的序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)針對(duì)其ICP4基因的特異性引物，對(duì)可疑病料和分離出的病原分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為ILTV。特異性和敏感性試驗(yàn)證實(shí)，新建立的PCR可快速、準(zhǔn)確地鑒定出病原，具有一定的臨床推廣應(yīng)用價(jià)值，為有效防控ILT的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：傳染性喉氣管炎;肉雞;病毒分離;PCR

中圖分類號(hào)：S858.31 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2020）8-0006-06

傳染性喉氣管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞上呼吸道的喉頭和氣管的上皮細(xì)胞，同時(shí)對(duì)鼻竇、氣囊和肺等組織產(chǎn)生影響。典型癥狀為呼吸困難、氣喘，咳出帶血分泌物;剖檢可見喉部和氣管粘膜腫脹、出血等，嚴(yán)重的病例則具有較高的致死性，死亡率可高達(dá)40%以上。除了ILT的典型癥狀外，ILT還可以表現(xiàn)為溫和型，具體表現(xiàn)為粘液性氣管炎、鼻炎、眼結(jié)膜炎、眼流淚等輕微癥狀[1]。傳統(tǒng)認(rèn)為該病大多數(shù)發(fā)生于成年雞和產(chǎn)蛋雞，但近來，低日齡肉雞發(fā)生ILT的病例屢見不鮮，呈明顯的上升趨勢(shì)。

ILTV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，只有一個(gè)血清型，不同ILTV毒株之間具有一定交叉保護(hù)。由于傳染性喉氣管炎與傳染性支氣管炎、低致病性禽流感和新城疫等家禽疫病在臨床癥狀方面比較相似，單純從臨床癥狀很難與其他病原相鑒別。

鑒于ICP4基因是ILTV的保守基因，且與同亞科其它屬成員的同源性較低[2，3]，故本文設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性擴(kuò)增ICP4基因的引物，進(jìn)而建立一種簡便、快速和準(zhǔn)確診斷ILTV的PCR方法。

1 ?材料和方法

1.1 ?發(fā)病背景 ?2019年4月～2020年4月，山東萊蕪、臨沂、濰坊等地規(guī)?；u場(chǎng)陸續(xù)發(fā)生了一種以嚴(yán)重呼吸困難、咳血、氣管粘膜出血和充血的雞病，主要危害20～50日齡的白羽商品肉雞和地方品種雞，以30～35日齡居多。雞群一旦感染，則傳播較快，感染率在80%以上，死亡率在5%～30%，嚴(yán)重的死亡率可高達(dá)45%，治療效果不佳，發(fā)病周期較長，可持續(xù)1月，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

1.2 ?病料處理 ?剖檢具有典型癥狀的發(fā)病雞或死亡雞，取其氣管粘膜或刮取粘膜血痰作為病料。病料剪碎后按1∶3的比例加入滅菌PBS溶液，同時(shí)加入青、鏈霉素（2000 IU/mL）-4 ℃冰箱過夜處理。然后，反復(fù)凍融3次后離心取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.3 ?主要試劑、材料和儀器 ?Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購自杭州博日科技有限公司;DNA回收試劑盒購自天根生物科技有限公司;10×Taq PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTP，均購自湖南艾科瑞生物過程有限公司;DL2000bp DNA Marker，購自寶生物（北京）有限公司;PCR儀，購自Thermo Fisher公司;9～10日齡SPF雞胚由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。

1.3 ?SPF雞胚接種 ?將無菌檢驗(yàn)合格的上清液經(jīng)絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種10日齡SPF雞胚，每日照蛋觀察，舍棄48 h內(nèi)非特異性死亡雞胚，觀察至120 h，死亡胚和120 h活胚及時(shí)放置-4 ℃冰箱并保存過夜。在生物安全柜內(nèi)，觀察雞胚和CAM病變[5]。待觀察完，將CAM剪碎研磨，加入PBS稀釋，反復(fù)凍融3次，離心取上清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ?PCR診斷

1.4.1 ?引物設(shè)計(jì) ?參考GenBank中ILTV經(jīng)典株的ICP4基因序列，利用Prime preimer5.0軟件設(shè)計(jì)ICP4基因的擴(kuò)增引物IF和IR，引物由華大基因合成。

IF：5'-CCACCATACCCATACGAAACG-3';IR：5'-GCAGAGGACCAGCAAAGACC-3'。

1.4.2 ?核酸提取 ?按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取樣品的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 ?條件優(yōu)化 ?PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，待檢DNA模板2 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，最后用RNA-free補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min;進(jìn)入98 ℃變性10 s，共設(shè)置6個(gè)退火溫度（53、54、55、56、57 ℃和58 ℃）退火30 s，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，并在凝膠成像儀觀察其條帶大小和亮度，選擇和優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.4.4 ?特異性 ?采用優(yōu)化的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，將ICP4基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，連接于pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，PCR鑒定的陽性菌落接種LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，送華大基因測(cè)序。同時(shí)，利用該方法對(duì)新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞毒支原體（MG）、H9N2等禽類其它病原的DNA（cDNA）進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證該引物PCR反應(yīng)的特異性。

1.4.5 ?敏感性 ?將提取的ILTV基因組DNA樣品用NanoDropTM One/OneC超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量和純度測(cè)定后，10倍稀釋成六個(gè)梯度，分別取1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定檢測(cè)該方法的靈敏度。

1.5 ?系統(tǒng)發(fā)育樹 ?對(duì)克隆的ICP4基因進(jìn)行基因測(cè)序，從GenBank中選擇不同時(shí)間、地域的ILTV分離株ICP4核苷酸序列，利用Lasergen 7.1和MEGA5軟件，比較其核苷酸同源性，并采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建支原體的系統(tǒng)發(fā)育樹，探討不同ILTV之間的遺傳距離和系統(tǒng)演化關(guān)系。

2 ?結(jié)果

2.1 ?臨床病變和病原分離 ?臨床發(fā)病雞表現(xiàn)為典型的呼吸困難、氣喘，咳出帶血分泌物。剖檢可見喉部和氣管粘膜腫脹、出血（見圖1），具有ILT的典型病變特征。

將病料上清接種SPF雞胚，120 h內(nèi)未出現(xiàn)雞胚死亡。剖檢雞胚發(fā)現(xiàn)：接種胚的CAM明顯增厚，接種部位出現(xiàn)典型的痘斑，具體表現(xiàn)為邊緣增厚，中間凹陷，見圖2;且接種雞胚與空白對(duì)照組相比，接種組雞胚明顯發(fā)育較小，部分雞胚胚體出血。該結(jié)果證實(shí)，分離到一株疑似ILTV毒株，并將其命名為SD20。

2.2 ?PCR方法的建立

2.2.1 ?條件優(yōu)化 ?進(jìn)行了退火溫度的篩選，結(jié)果表明，PCR在53～58 ℃均能擴(kuò)增，但以56 ℃效果最佳。

2.2.2 ?特異性檢測(cè) ?檢測(cè)結(jié)果見圖3。由圖3可見，該P(yáng)CR反應(yīng)對(duì)新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞毒支原體（MG）、H9N2等禽類其它病原的DNA（cDNA）無反應(yīng)，僅與ILTV有特異性反應(yīng)。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果約為700bp，結(jié)果符合試驗(yàn)預(yù)期。

2.2.3 ?序列測(cè)定 ?對(duì)ILTV ICP4基因的測(cè)序測(cè)定表明，其基因長度為648bp。同源性比較顯示，SD20分離株ICP4基因與傳染性喉氣管炎雞胚疫

苗株（CEO）、中國ILTV經(jīng)典強(qiáng)毒王崗株（WG）和澳大利亞CL9毒株的同源性均為100%，與美國等其它ILTV分離株的同源性也在99.1%以上;但與α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬M(fèi)DV（JF742597）的同源性僅為24.4%，證實(shí)SD20分離株為ILTV。

2.2.4 ?敏感性檢測(cè) ?敏感性檢測(cè)結(jié)果見圖4。

當(dāng)樣品稀釋到10-3時(shí)，仍可見PCR陽性擴(kuò)增，表明PCR可檢測(cè)的最低核酸濃度為45.7 pg/μL。

2.3 ?系統(tǒng)發(fā)育樹 ?系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。由圖5可見，SD20株與ILTV CEO疫苗株、中國經(jīng)典強(qiáng)毒W(wǎng)G株等處于同一分支，顯示出較近的親緣關(guān)系;與我國2013年廣東ILTV流行株、2011年安徽ILTV流行株基本相同，處在同一分支，推測(cè)是同一類ILTV流行野毒;與ILTV組織培養(yǎng)疫苗株（TCO）、俄羅斯2009年ILTV流行株、美國2012年ILTV流行株等處于相鄰的分支，具有一定的差異性。比較特殊的是，SD20株與3株澳大利亞2014～2019年ILTV分離株遺傳距離較遠(yuǎn)，處在兩個(gè)遺傳演化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的分支。

3 ?討論

3.1 ?成功從商品肉雞中分離到一株傳染性喉氣管炎病毒SD20株，在SPF雞胚上產(chǎn)生了典型的痘斑病變，進(jìn)行了序列測(cè)定 ?測(cè)序結(jié)果表明，SD20株ICP4基因片段長度為648bp，與ILTV疫苗株CEO、中國WG株的核苷酸同源性為100%，確證了本次發(fā)生在商品肉雞、地方肉雞上的疫情為ILT。至于ILTV的來源，目前尚有爭論：一方面有人推測(cè)可能來源于免疫雞群的帶毒和散毒;另一方面，推測(cè)與臨床大量使用雞胚來源的ILTV疫苗有關(guān)。已有研究證實(shí)，2008年美國商品肉雞發(fā)生的ILT可能與CEO疫苗使用有關(guān)[6]。SD20是否來源于ILTV CEO疫苗株，尚需進(jìn)行大量深入細(xì)致的研究工作和評(píng)價(jià)，以求獲得更多的證據(jù)。

3.2 ?建立了一種可靠的PCR方法，可用于ILTV的快速診斷和確診 ?ICP4基因是ILTV的保守基因，與皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科本屬成員同源率接近100%，而與其它亞科成員的同源性較低（不足30%），這樣就明確了本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物特異性高，與常見的其它呼吸道病原如NDV、IBV等均不發(fā)生反應(yīng)，且具有較高的敏感性，可檢測(cè)到DNA最低濃度為45.7 pg/μL，適合于臨床ILT的定性檢測(cè)。

3.3 ?眾多的免疫研究表明，ILT的免疫主要是細(xì)胞免疫 ?活疫苗是控制傳染性喉氣管炎最重要的手段。一般而言，3周齡以內(nèi)的雛雞對(duì)ILTV不易感，但成年雞和產(chǎn)蛋雞對(duì)ILT最易感。ILTV疫苗通常有雞胚疫苗（CEO）、組織培養(yǎng)疫苗（TOC）和雞痘重組疫苗（RFP）三種，其中TOC疫苗只能點(diǎn)眼，重組疫苗RFP只能肌注，只有CEO疫苗既可飲水又可點(diǎn)眼或肌注，各種免疫途徑都適合。但是，CEO疫苗在雞體內(nèi)反復(fù)傳代，具有毒力復(fù)壯的潛在威脅，已為大量文獻(xiàn)所證實(shí)。組織培養(yǎng)疫苗（TOC）和雞痘重組疫苗免疫接種相對(duì)安全，但必須點(diǎn)眼或肌注等人為操作，比較耗時(shí)、費(fèi)力，花費(fèi)大量人力、財(cái)力和物力[6]。

CEO疫苗在生產(chǎn)中最常用。點(diǎn)眼接種弱毒疫苗是控制ILTV的重要技術(shù)措施。點(diǎn)眼接種適用于不同日齡的雞。一般不建議飲水免疫，會(huì)造成免疫失敗或疫苗株毒力返強(qiáng)等[7]。該疫苗具有一定的毒力，疫苗接種后，往往會(huì)有5%～10%的雞發(fā)生結(jié)膜炎，但一般在1周內(nèi)恢復(fù)。嚴(yán)重的可引起死亡。不能對(duì)4周齡以下的雛雞（對(duì)雛雞可致?。┖?8周齡以上的雞進(jìn)行接種（對(duì)開產(chǎn)前的雞有一定的致病性）。商品肉雞一般不免疫。特殊情況下，如周邊發(fā)生了ILT，則建議緊急疫苗免疫。一旦免疫，則至少需要連續(xù)免疫1～2年，在連續(xù)兩年內(nèi)無ILT發(fā)生時(shí)，則可考慮停止疫苗接種[8]。

3.4 ?ILT一旦發(fā)病，無特效藥治療

3.4.1 ?緊急接種和消毒 ?疫病發(fā)生后要迅速淘汰病雞和處置雞群，以防產(chǎn)生更大的損失。同時(shí)，隔離易感雞群，必要時(shí)緊急接種，疫苗接種可顯著降低發(fā)病損失并縮短發(fā)病時(shí)間。對(duì)發(fā)病和死亡的雞必須進(jìn)行嚴(yán)格無害化處理，防止疫病擴(kuò)散。徹底清洗建筑物和設(shè)備，可采用消毒劑如酚鹽、次氯酸鈉、碘伏或季銨鹽復(fù)合物進(jìn)行噴霧消毒。

3.4.2 ?對(duì)癥輔助治療 ?對(duì)于價(jià)值較大且不能淘汰的雞群，可應(yīng)用平喘藥物可緩解癥狀，每只雞可用鹽酸麻黃素10 mg/d或氨茶堿50 mg/d，飲水或拌料投服，連用4～5 d;0.2%氯化銨飲水，連用2～3 d。可采用地塞米松、卡那霉素和泰樂菌素等飲水，防止繼發(fā)細(xì)菌感染。

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Abstract： Infectious laryngotracheitis（ILT） is an important respiratory disease in poultry， which mainly harms adult chickens and laying hens. However，since April 2019， a number of commercial broilers and local breed broilers have been infected by infectious laryngotracheitis virus in many areas of Shandong Province，and have led to serious outbreaks.The disease is characterized by anorexia，depression，and ?serve respiratory distress，with coughing，sneezing，gurgling，gasping，and rales.The trachea is often partially occluded，and bloody，mucous exudates may be expelled during violent expectorating efforts.The ILT virus（ILTV）was isolated by inoculation of chorioallantoic membrane（CAM）of 10- day-old developing of SPF chicken embryos.Lesions developed on the 5 days post-infection.Referring to and combining the sequence of infectious laryngotracheitis virus （ILTV） in the GenBank，a pair of specific primers were designed to target its ICP4 genes， and the target bands were PCR amplified for suspicious and isolated pathogens which were confirmed as ILTV by sequencing.The specificity and sensitivity experiments confirmed that the newly established PCR can identify pathogens quickly and accurately， and has certain clinical popularization and application value， which lays a foundation for effective prevention and control of ILT.

Key words： Infectious laryngotracheitis;broilers;virus isolation;PCR