云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚成熟影響因素研究進(jìn)展

依巴代提·木合旦爾 伊達(dá)婭提·木合旦爾

摘要 云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生能力受多種因素的影響。體細(xì)胞胚萌發(fā)困難的一個(gè)重要原因就是體細(xì)胞胚沒(méi)有經(jīng)過(guò)一個(gè)完整的成熟過(guò)程。體細(xì)胞胚的成熟受到多方面因素的影響，包括物理因子、糖類、PEG、基因型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、成熟時(shí)間和各種離子等因素。綜述了云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚成熟影響因素的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)只有云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚真正成熟并同步萌發(fā)，才可以利用云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚進(jìn)行工廠化育苗。

關(guān)鍵詞 云杉屬;體細(xì)胞胚;成熟;因素

中圖分類號(hào) S718.46 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）18-0011-03

Abstract Somatic embryogenesis and plant regeneration ability of Picea were affected by many factors.One of the important reasons for the difficulty of somatic embryo germination is that somatic embryo does not go through a complete maturation process.The maturation of somatic embryos is influenced by many factors， including physical factors， sugars， peg， genotypes， plant growth regulators， maturation time， and various ions. Through the factors affecting the maturation of somatic embryos，the real mature and synchronous germination of somatic embryos of Picea were described，which could be used to improve the yield and quality of somatic embryos of Picea and to carry out industrial seedling raising.

Key words Picea;Somatic embryo;Mature;Factors

云杉（Picea）屬松科較重要的一個(gè)屬，為裸子植物松科的常綠喬木，云杉屬樹(shù)種全世界約有40種，主要分布在亞洲、北美洲和歐洲。我國(guó)云杉屬樹(shù)種資源豐富，有17種9變種，另引種栽培2種[1-7]。云杉屬樹(shù)種具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)等特性，廣泛用于造林和園林綠化[1]。另外，云杉屬樹(shù)種在山地森林中分布最廣、蓄積量最大，是構(gòu)成森林生態(tài)系統(tǒng)的主體，對(duì)維持山地乃至區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)平衡和改善生態(tài)環(huán)境質(zhì)量等方面具有舉足輕重的作用[6，8]。云杉屬樹(shù)種的種子繁殖需要4～5年才能獲得可移栽的幼苗，生長(zhǎng)較慢，自然育種與優(yōu)良基因型選擇效率較低[7，9]，在涵養(yǎng)水源、保持水土、保護(hù)山區(qū)牧業(yè)基地和提供建筑用材等方面有著舉足輕重的作用。

體細(xì)胞胚的成熟是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，既受外部因素的影響，又與本身的發(fā)育程度有關(guān)[10]。對(duì)于成熟體細(xì)胞胚的具體形態(tài)指標(biāo)研究較少，多數(shù)研究將白色或象牙色不透明體細(xì)胞胚作為成熟體細(xì)胞胚的外部特征，而對(duì)于成熟體細(xì)胞胚的大小，由于物種差異沒(méi)有一個(gè)明確的規(guī)定[11]。自1985年Hakman等[12]首次報(bào)道挪威云杉（Picea abies Karst）的未成熟合子胚形成體細(xì)胞胚胎并再生完整植株以來(lái)，不同樹(shù)種的外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，云杉屬樹(shù)種組織培養(yǎng)方面的研究取得了較大的進(jìn)展和豐碩的成果[1，7，12-15]。云杉屬樹(shù)種天然更新不良和保障成為困惑林業(yè)工作者的一大問(wèn)題[12-13]。經(jīng)過(guò)近30年努力，國(guó)內(nèi)外有10多種云杉屬樹(shù)種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生。目前，已經(jīng)有很多植物可以成功地誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，但在促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟，并將體細(xì)胞胚成功地轉(zhuǎn)化為植株的過(guò)程中仍存在很多問(wèn)題。一些植物的體細(xì)胞胚可以順利地成長(zhǎng)到子葉形胚階段，但萌發(fā)率很低，甚至是不萌發(fā)或萌發(fā)后為畸形苗。自Steward等[16]和Reinert[17]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜根細(xì)胞離體培養(yǎng)可通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生形成再生植株后，人們?cè)诖罅康闹参锝M織培養(yǎng)、單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到了體細(xì)胞胚胎發(fā)生[18-20]。1993年，已有210種植物成功地誘導(dǎo)出胚狀體[21]。目前研究多停留在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生條件的摸索以及生理生化、組織學(xué)的研究方面[19，22]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)在云杉屬樹(shù)種中的應(yīng)用，為其品種改良和規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化繁殖提供了基礎(chǔ)[1]，筆者綜述了云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚胎成熟影響因素的研究進(jìn)展。

1 物理因子對(duì)植物體細(xì)胞胚成熟的影響

1.1 光照

光照的作用主要體現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)與光照時(shí)間3個(gè)方面。鄧向陽(yáng)等[23]在研究光強(qiáng)對(duì)花生體細(xì)胞胚發(fā)生及再生體系的建立中發(fā)現(xiàn)，光下體細(xì)胞胚無(wú)明顯的根端，芽端雖明顯變綠，但往往發(fā)育不充分，停滯于魚(yú)雷期或更早時(shí)期。翁浩等[24]研究不同因素對(duì)金花茶體細(xì)胞胚成熟的影響，結(jié)果表明，在紅光、藍(lán)光、綠光、白光培養(yǎng)條件下，只有白光誘導(dǎo)下體細(xì)胞胚成熟，其他光質(zhì)下體細(xì)胞胚極少成熟。另外，光照對(duì)植物體細(xì)胞胚成熟的影響與培養(yǎng)基中糖的含量有關(guān)。當(dāng)糖濃度較高時(shí)，光照對(duì)植物體細(xì)胞胚的成熟影響不大，而糖濃度較低時(shí)，光照可促進(jìn)植物體細(xì)胞胚的早熟萌發(fā)。關(guān)于光照對(duì)體細(xì)胞胚成熟的影響較少。賴鐘雄等[25]、王立忱[26]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖下，光照對(duì)龍眼體細(xì)胞胚成熟沒(méi)有明顯的影響;在低糖下，光照可減少胚狀體因透明化而引起的死亡，但胚狀體早熟萌發(fā)。

1.2 通風(fēng)條件

在植物體細(xì)胞胚培養(yǎng)中，不通風(fēng)，有利于體細(xì)胞胚的成熟，且體細(xì)胞胚的數(shù)量高于通風(fēng)的情況。Meskaoui等[27]研究顯示密封條件可促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟并限制早熟萌發(fā)。在密封微環(huán)境中進(jìn)行黑皮云杉的成熟體細(xì)胞胚培養(yǎng)，其數(shù)量與正常通風(fēng)條件下相比增加。

1.3 溫度

低溫冷凍可促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟，并對(duì)體細(xì)胞胚的同步化有促進(jìn)作用[10]。不同植物品種對(duì)溫度的影響不同。Bonga[28]研究發(fā)現(xiàn)，-5、-10、-18 ℃冰凍至少270 d，可促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟。對(duì)于冷凍促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟的方法，研究認(rèn)為，與某些植物的種子需經(jīng)低溫處理才會(huì)發(fā)芽類似，此類植物的體細(xì)胞胚也可能需要低溫處理才能發(fā)芽并正常發(fā)育，此類模仿種子發(fā)芽的處理，其作用可能是通過(guò)冷激的方法打開(kāi)體細(xì)胞胚發(fā)芽及苗體發(fā)育的必要生理代謝機(jī)制[10，26，29]。

2 糖類

糖類作為細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源，不僅為體細(xì)胞胚發(fā)育提供能量，還可調(diào)節(jié)滲透壓。常用的糖類有蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等。齊力旺等[30]研究發(fā)現(xiàn)用麥芽糖代替蔗糖，不但明顯提高體細(xì)胞胚的成熟頻率，而且使體細(xì)胞胚發(fā)生時(shí)間提前7 d;不添加蔗糖，3%麥芽糖+4%PEG 4000時(shí)，體細(xì)胞胚成熟頻率最高。高濃度麥芽糖（6%、9%）可促進(jìn)黑松體細(xì)胞胚成熟及萌發(fā)[31]。低濃度的蔗糖一般不利于體細(xì)胞胚的成熟，但賴鐘雄等[32]在龍眼胚性愈傷組織的高頻率體細(xì)胞胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，低糖不但可提高體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率，而且減少畸形胚的出現(xiàn)。這可能與不同植物種類體細(xì)胞胚發(fā)育對(duì)碳源和滲透壓的特殊要求有關(guān)[10，18，20]。培養(yǎng)基中的糖濃度高，可使培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓提高，引起細(xì)胞失水，使得體細(xì)胞胚出現(xiàn)脫水現(xiàn)象，從而促進(jìn)植物體細(xì)胞胚的成熟。然而，如果培養(yǎng)基中的糖濃度過(guò)高，會(huì)使得植物體細(xì)胞胚出現(xiàn)玻璃化或培育出畸形苗[33]。張建偉等[34-35]研究表明，60和 90 g/L 2個(gè)蔗糖濃度處理下幾乎無(wú)成熟體細(xì)胞胚產(chǎn)生，推測(cè)可能是因?yàn)闈B透壓過(guò)高，抑制了體細(xì)胞胚的產(chǎn)生。10和30 g/L 2個(gè)蔗糖濃度處理下獲得的體細(xì)胞胚數(shù)量較多;而30 g/L蔗糖處理下獲得體細(xì)胞胚健壯，萌發(fā)率高。因此，該試驗(yàn)中最佳的蔗糖處理濃度為30 g/L，平均有168個(gè)/g。

3 PEG

乙二醇（PEG）是一種高分子量的化合物滲透劑，與一些小分子滲壓劑如蔗糖和甘露醇相比，其最大特點(diǎn)是本身不能滲透植物細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，因而不會(huì)引起質(zhì)壁分離，使植物組織和細(xì)胞處于類似干旱的水分脅迫之中，從而使細(xì)胞合成相應(yīng)的脅迫蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)代謝，促使體細(xì)胞胚成熟[36]。研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的PEG有明顯地促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟的作用，用PEG作培養(yǎng)基的滲透劑可明顯提高植物體細(xì)胞胚的成熟率。這可能是由于PEG可引起水分脅迫，抑制了體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，從而調(diào)節(jié)代謝，促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)育導(dǎo)致的。美國(guó) Weyerhauser 公司已證明同時(shí)使用 PEG、ABA 和活性炭對(duì)改善針葉樹(shù)體細(xì)胞胚成熟和儲(chǔ)藏物質(zhì)的形成十分有效[37]。Attree等[36-37]研究發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有 ABA 時(shí)，白云杉體細(xì)胞胚不能成熟，但附加40 mmol/L PEG和100 mmol/L AgNO3時(shí)，可促進(jìn)白云杉體細(xì)胞胚的成熟[10，38]。Li等[38]研究火炬松體細(xì)胞胚成熟中也有類似的發(fā)現(xiàn)。PEG發(fā)揮功效主要是結(jié)合碳因素一起使用，且在依賴于麥芽糖附加時(shí)，較高濃度的PEG更能增加體細(xì)胞胚成熟的頻率[39]。

4 基因型

基因型是影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生的一個(gè)重要因素已被許多學(xué)者所認(rèn)可，基因型也影響植物體細(xì)胞胚的成熟。Kintzios等[40]對(duì)甜瓜體細(xì)胞胚發(fā)生及其植株再生的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，基因型明顯地影響體細(xì)胞胚發(fā)生率和體細(xì)胞胚成熟及植株再生。在14個(gè)甜瓜品種中，只有3個(gè)品種得到了充分發(fā)育的子葉胚。在4個(gè)石刁柏品種中，雖然所有的基因型都能再生小苗，但只有1種品種（Rutgers 22）成熟最好，成苗率最高。Mandal等[41]認(rèn)為，紅花體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)受到基因型的影響。李冬梅[42]對(duì)龍眼體細(xì)胞胚胎成熟機(jī)理的研究，依巴代提·木合旦爾等[6]對(duì)天山云杉體細(xì)胞胚的成熟及萌發(fā)條件均研究表明，基因型影響植物體細(xì)胞胚的成熟。LeluWalter 等[43]以海岸松（Pinus pinaster）控制授粉的8個(gè)基因型未成熟合子胚為外植體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)能力與基因型關(guān)系密切。因此，在開(kāi)展云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究時(shí)，為了獲得誘導(dǎo)能力較強(qiáng)的基因型，應(yīng)擴(kuò)大優(yōu)良基因型的篩選力度。

5 ABA

脫落酸（ABA）是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的一種激素，對(duì)植物體細(xì)胞胚的發(fā)生和發(fā)育具有多方面的影響，特別是在體細(xì)胞胚發(fā)育后期，即體細(xì)胞胚的成熟階段作用非常明顯。ABA調(diào)節(jié)植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中特異的基因表達(dá)，激活有關(guān)基因，合成胚胎特異性蛋白及體細(xì)胞胚內(nèi)脂，從而促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟[6-7，10]。研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以抑制體細(xì)胞胚的過(guò)早萌發(fā)，促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟并可提高體細(xì)胞胚的質(zhì)量，而在未添加ABA的培養(yǎng)基上，體細(xì)胞胚形態(tài)不正常，或液泡化，或不分裂[29，44]。ABA在提高針葉樹(shù)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生頻率及質(zhì)量中有重要作用。青海云杉的體細(xì)胞胚成熟試驗(yàn)表明，同時(shí)加入不同濃度的ABA，當(dāng)ABA含量為30 mg/L時(shí)，2個(gè)種源1 g胚性組織獲得的正常體細(xì)胞胚數(shù)量最多。青海云杉體細(xì)胞胚發(fā)育與成熟過(guò)程中，當(dāng)ABA含量為5.28 mg/L時(shí)，2個(gè)種源1 g胚性組織獲得的正常體細(xì)胞胚數(shù)量最多[45]。

6 成熟時(shí)間

成熟時(shí)間對(duì)植物體細(xì)胞胚的成熟也有很重要的作用。植物細(xì)胞胚也如同自然界中的植物一樣，不經(jīng)歷一定的時(shí)間體細(xì)胞胚無(wú)法成熟萌發(fā)。成熟時(shí)間過(guò)短，植物體細(xì)胞胚成熟不夠，無(wú)法正常萌發(fā)，一般情況下可以生根，但萌芽困難，或者萌芽后葉片無(wú)法展開(kāi)，也有可能發(fā)育成玻璃化幼苗。成熟時(shí)間適當(dāng)，植物體細(xì)胞胚完全成熟，可以正常萌發(fā)出根和葉，后期生長(zhǎng)良好。成熟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，萌芽率有所提高，但易使根的生長(zhǎng)受到抑制，這可能是由于根原基的分化早于芽原基的分化，體細(xì)胞胚在成熟培養(yǎng)基上的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使得已分化的根原基受到損壞，因此使得根的生長(zhǎng)受到破壞。因此，把握好植物體細(xì)胞胚的成熟時(shí)間對(duì)體細(xì)胞胚的正常萌發(fā)生長(zhǎng)也非常重要[44]。

7 各種離子

高等植物必需營(yíng)養(yǎng)元素為N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Zn、Cu、Mo、B、C1、C、H、H和Ni[46-47]。因植物對(duì)必需營(yíng)養(yǎng)元素的需要量不同以及同種植物不同階段的耗量也不同，應(yīng)針對(duì)具體試驗(yàn)?zāi)康目紤]這些離子的濃度。氮作為各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)及核酸的重要組成部分，對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生有一定的影響。培養(yǎng)基中氮主要以鉸態(tài)氮、硝態(tài)氮2種形式被利用，張萬(wàn)軍等[48]、韓曉玲等[49]研究顯示，高氮含量對(duì)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育有重要的促進(jìn)作用。磷參與細(xì)胞呼吸能量?jī)?chǔ)存轉(zhuǎn)化及釋放等重要的生命活動(dòng)，并常以磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）等鹽的形式供給。鉀與碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)移以及氮因素代謝等有密切的關(guān)系，主要由氯化鉀（KCI）、硝酸鉀（KNO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）等提供[47，50]。大多數(shù)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)制研究主要考慮的都是氮源及一些金屬離子。胡忠等[51]對(duì)寧夏枸杞進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加鈣離子和硝酸銀能有效地促進(jìn)胚性愈傷組織的生長(zhǎng)，形成的體細(xì)胞胚數(shù)量幾乎可達(dá)對(duì)照的2倍[51]。在未加任何激素時(shí)，分別添加碳酰氯（CoCl2）、氯化鎳（NiCl2）、氯化銅（CuCl2）、氯化鋅（ZnCl2）、氯化鎘（CdCl2）均可誘導(dǎo)胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生以及成熟[47，52]。

8 結(jié)語(yǔ)

影響體細(xì)胞胚成熟的重要因素還有很多，而且這些因素并不是單獨(dú)地起作用，往往各個(gè)因素間會(huì)互相作用，共同影響體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)，因此，深入研究影響體細(xì)胞胚成熟的主要因素，找出最適合的云杉屬樹(shù)種體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基種類、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合、培養(yǎng)環(huán)境、成熟時(shí)間等主要因子是成功培養(yǎng)體細(xì)胞胚的重要工作。這些研究將為云杉屬種質(zhì)資源的保護(hù)提供理論依據(jù)，為體細(xì)胞胚胎發(fā)生在林業(yè)生產(chǎn)上的實(shí)際應(yīng)用作出貢獻(xiàn)。因此，應(yīng)在以后的工作中加強(qiáng)這方面的研究。

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