荊雅瑋,左佳坤,,王志豪,胡劍剛,黃燕,米榮升,苗晉鋒,PHOUTHAPANE Vanhnaseng,陳兆國,韓先干*

(1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241;2.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京 210095;3.老撾科技部生態(tài)與生物技術研究所,萬象 22797)

布氏桿菌病是一種重要的人畜共患傳染病,由布氏桿菌(Brucella)入侵機體引起,世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)將該病列為必須通報的疫病,我國將其列為二類動物疫病。人感染該病后主要表現(xiàn)為發(fā)熱、關節(jié)痛、全身乏力和多汗等癥狀,動物感染該病后主要表現(xiàn)為母畜流產(chǎn)、子宮炎、關節(jié)炎和睪丸炎等癥狀。全世界每年布氏桿菌發(fā)病人數(shù)超過50萬例,170多個國家有該病發(fā)生[1]。該病不但對養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失,同時也嚴重威脅食品安全和公共衛(wèi)生,開展布氏桿菌致病機制研究,可為該病的有效防控提供理論支撐。

由sahH基因編碼的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SahH)廣泛存在于細胞中,并在新陳代謝過程中起重要作用[2-3]。對SahH在人及其他真核細胞中的研究表明,SahH可引起包括腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及肌肉病變等在內的多種疾病[4-6]。而SahH在細菌中的研究較少,SahH參與細菌的甲硫氨酸循環(huán),甲硫氨酸通過ATP活化和去甲基化后形成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH),SAH在SahH的催化作用下生成同型半胱氨酸(homocysteine,HCY),HCY再重新生成甲硫氨酸的過程,稱為甲硫氨酸循環(huán)[7-8]。甲硫氨酸循環(huán)在細菌的DNA合成、蛋白質翻譯和甲基化等過程中發(fā)揮重要作用。

對埃氏慢生根瘤菌SahH的晶體結構研究表明,SahH由4個亞基組成,每個亞基由底物結合位點、輔因子結合位點和羧基端二聚體組成,并由于輔因子的結合,通過形成開放和閉合兩種構象,影響其催化活性[9]。在影響SahH催化活性的眾多因素中,NAD+作為輔因子,參與調控包括結核桿菌、海洋熱菌等在內的多種細菌的SahH催化活性[10]。研究表明,維持細胞的SAH/SAM平衡,對其發(fā)揮生理功能具有重要的調節(jié)作用,而SahH的活性是維持SAH/SAM平衡的關鍵。因此,通過調控布氏桿菌SahH的催化活性,實現(xiàn)對其胞內SAM/SAH平衡的調控,可為布氏桿菌病的防控提供新思路。

目前關于布氏桿菌SahH的研究較少,僅有對其免疫原性和催化活性研究,尚未見影響其催化活性的研究,因此本試驗在本課題組前期研究基礎上,進一步研究影響其催化活性的因素并鑒定可能的催化活性位點,為后續(xù)開展SahH對布氏桿菌的調控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒以及試劑

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞、質粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;表達布氏桿菌SahH(Bru-SahH)的表達載體pET28a-Bru-sahH由本課題組前期構建[11]。限制性內切酶、DNA Marker以及高保真酶購自大連TaKaRa公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.2 NAD+對SahH催化活性的影響

將表達質粒pET28a-Bru-sahH轉化大腸桿菌BL21,用終濃度為1 mmol·L-1IPTG誘導表達重組蛋白Bru-SahH,純化后備用[11-12]。

重組蛋白Bru-SahH體外催化活性分析方法參照文獻[11-12],采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對純化的各梯度蛋白進行濃度測定,并取純化后終濃度為1 mg·mL-1Bru-SahH重組蛋白200 μL與終濃度為 1 mmol·L-1底物SAH作用,同時添加終濃度為100 μmol·L-1外源性NAD+,37 ℃孵育1 h。反應結束后反應液用蛋白超濾管進行離心、超濾,去除反應液中的蛋白后,收集濾液,檢測催化產(chǎn)物HCY的生成量,同時以PBS緩沖液作為陰性對照。重復3次。

催化產(chǎn)物HCY的濃度檢測方法參照文獻[13],DTNB[5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)]是一種Ellman’s試劑,可以通過與HCY中的巰基反應,轉化成為黃色的 5-巰基-2-硝基苯甲酸,測定412 nm處吸收峰值可確定底物反應液中的HCY含量。將200 μL重組蛋白濾液與100 μL 5 mmol·L-1Ellman’s試劑充分混勻,37 ℃培養(yǎng)箱靜置避光孵育30 min,檢測反應液的吸光值(A412),根據(jù)HCY標準曲線測定重組蛋白SahH的催化活性(HCY的產(chǎn)量)。

1.3 SahH理化特性分析、磷酸化及活性位點鑒定

通過蛋白質理化特性預測網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)分析SahH的理化特性。為了進行SahH的磷酸化位點檢測,將重組表達的Bru-SahH經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后,切膠送至上海厚基生物科技有限公司進行磷酸化質譜分析。

分別選取流產(chǎn)布氏桿菌(Brucellaabortus,EEP62727.1)、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,NC_000962.3)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,JQ894861.1)、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderiapseudomallei,CAH37303.1)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum,BAL09033.1)、黃桿菌(Flavobacteriabacterium,EAZ95386.1)和哈維弧菌(VibrioharveyiCAIM,EMR35983.1)的SahH氨基酸序列,運用DNAStar等軟件,對SahH可能的活性位點進行預測。

1.4 sahH突變表達質粒的構建、表達

通過點突變引物(表1),利用重疊引物延伸PCR(overlap PCR)對表達載體pET28a-sahH的第337位(His)、338位(Phe)和第444位(Ser)氨基酸分別進行單點突變,對337和338位氨基酸進行雙突變,構建sahH點突變質粒(表2)。將突變后的重組表達質粒轉化BL21(DE3)菌株,IPTG誘導表達突變的SahH,純化后備用。

表1 本研究所用引物

表2 SahH定點突變

1.5 SahH突變株的體外催化活性分析

純化表達的4種SahH突變重組蛋白,采用BCA法測定其濃度。將終質量濃度為4 mg·mL-1的4種SahH突變重組蛋白分別與終濃度為1 mmol·L-1SAH混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置孵育1 h,以未突變的SahH作為催化反應的陽性對照,以PBS緩沖液作為陰性對照,評價SahH突變重組蛋白的體外催化活性。

2 結果與分析

2.1 NAD+抑制SahH的體外催化活性

對SahH的催化活性檢測結果表明,添加終濃度為100 μmol·L-1的NAD+后,SahH對底物的催化活性降低85.6%,表明NAD+對SahH的催化活性具有抑制作用(表3)。

表3 NAD+對SahH催化活性的影響

2.2 Bru-SahH理化特性與活性位點分析

對Bru-SahH的理化特性分析表明,該蛋白含有466個氨基酸(相對分子質量50.79×103),理論等電點5.30,帶負電荷殘基數(shù)(天冬氨酸+谷氨酸)為61,帶正電荷殘基數(shù)(精氨酸+賴氨酸)為49,不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為32.40,表明該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白。脂溶指數(shù)(aliphatic index)為88.13,總平均親水性(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.148。

質譜分析結果表明,Bru-SahH的第444位絲氨酸為預測的磷酸化修飾位點(圖1)。

對流產(chǎn)布氏桿菌、結核分枝桿菌、類鼻疽伯克氏菌、銅綠假單胞菌、黃桿菌、哈維弧菌和大豆根瘤菌的SahH氨基酸活性位點分析表明,布氏桿菌SahH的第337和338位存在組氨酸(H)和苯丙氨酸(F)活性位點(圖2)。

2.3 sahH突變表達載體的鑒定

測序結果表明,成功構建布氏桿菌sahH的第337、338、444位單突變和337-338位點雙突變的4種表達質粒,分別為pET28a-sahH-M337、pET28a-sahH-M338、pET28a-sahH-M444和pET28a-sahH-M337-338(表2,圖3)。

2.4 Bru-SahH重組突變蛋白的表達、純化

將構建的4種sahH突變表達質粒分別轉化BL21(DE3),用T7通用引物對重組菌進行PCR鑒定,結果表明成功獲得含sahH突變質粒的BL21重組菌(圖4)。

含有不同sahH突變質粒的BL21重組菌,均可表達相對分子質量為55×103的Bru-SahH突變蛋白,與預期結果相符。對突變的Bru-SahH蛋白進行純化,結果表明當咪唑濃度為100和150 mmol·L-1時,Bru-SahH 蛋白的洗脫效率較高(圖5)。

2.5 Bru-SahH重組突變蛋白的體外催化活性分析

對突變的Bru-SahH催化活性檢測結果(表4)表明,Bru-SahH的第337位和338位氨基酸突變后,其催化活性降低90.8%以上;Bru-SahH的第444位絲氨酸為磷酸化位點,對該位點突變后,其催化活性降低85.5%。

表4 Bru-SahH重組突變蛋白的催化活性

3 討論

甲硫氨酸代謝對細菌具有重要的調控作用,參與包括DNA復制與修復[14]、磷脂合成和群體感應等過程。SahH是甲硫氨酸循環(huán)過程中的關鍵酶[15-16],在多種疾病(包括癌癥、高膽固醇血癥、寄生蟲及病毒性傳染病)中被作為潛在的藥物靶標。如在結核病防治中,SahH被提出可作為一種具有前景的藥物靶標[17-19]。在人體細胞中SahH功能障礙可引起包括腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及肌肉病變在內的多種疾病。在布氏桿菌中,SahH參與甲硫氨酸循環(huán),但對其催化活性的分子機制尚不清楚。

為了探討影響布氏桿菌SahH催化活性的因素,本研究開展了NAD+對SahH催化活性的影響,結果表明NAD+對SahH的催化活性具有抑制作用。這可能是由于輔因子NAD+可通過氫鍵和疏水作用與SahH上特定的氨基酸殘基相互作用所致。例如在人的SahH中,由于NAD+與SahH的氨基酸殘基Asn191、Val224、Ile244和Thr276形成疏水作用和相互作用,從而影響其催化活性[20]。而與NAD+具有相互作用的氨基酸殘基可用于作為抑制劑設計的靶位點,同時NAD+的類似物也可作為SahH的抑制劑。

為了進一步分析影響SahH活性的位點,對埃氏慢生根瘤菌的SahH晶體結構研究表明,SahH由4個亞基組成,每個亞基由底物結合位點(substrate-binding domain)、輔因子結合位點(cofactor-binding domain)和羧基端二聚體(C-terminal dimerization domain)組成,并具有開放和閉合2種構象,而調節(jié)這種構象的關鍵是2個相連的氨基酸-組氨酸和苯丙氨酸(HF)[9]。本試驗通過對布氏桿菌和其他細菌的SahH進行序列比對,結果發(fā)現(xiàn)布氏桿菌SahH也存在第337位組氨酸和第338位苯丙氨酸,通過對SahH上述2個位點的突變,證明第337位組氨酸和第338位苯丙氨酸參與調控SahH的催化活性。突變337位和/或338位氨基酸后,可能破壞了控制布氏桿菌SahH的開放與閉合構象的分子閘門,無法暴露出底物結合位點與輔因子結合位點,進而使布氏桿菌SahH無法結合底物SAH,而使其催化活性大大降低,具體機制仍有待進一步研究。

磷酸化是影響蛋白質活性的重要方式,為了分析SahH可能的磷酸化位點,本試驗通過質譜分析,預測布氏桿菌SahH的第444位絲氨酸是潛在的磷酸化修飾位點,突變后其催化活性顯著降低,表明該位點在SahH催化活性中具有重要作用。有研究表明,在結核分枝桿菌中,SahH通過被細菌的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化,實現(xiàn)其對酶活的調控[21]。因此,在本試驗中,推測當布氏桿菌SahH的第444位絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷?布氏桿菌SahH無法被磷酸激酶磷酸化,進而使酶催化活性顯著下降。

本試驗采用測定SahH催化產(chǎn)物HCY的濃度評價SahH活性位點和氧化型輔酶NAD+對其催化活性的影響,在后續(xù)的研究中,將通過開展對布氏桿菌SahH酶活單位、催化反應速度和米氏常數(shù)等參數(shù)的研究,進一步研究SahH催化活性及其影響因素,為開展布氏桿菌SahH功能研究和基于SahH開展布氏桿菌防控提供新思路。