廖寶鵬，王崧嫚，杜明偉，李芳軍，田曉莉，李召虎

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物化控研究中心/ 植物生長調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心，北京100193）

棉花屬于勞動(dòng)密集型大田經(jīng)濟(jì)作物，特別是在收獲環(huán)節(jié)需要大量的人工投入[1]。 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件的變化，農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力日漸短缺，勞動(dòng)用工價(jià)格提高， 實(shí)現(xiàn)棉花機(jī)械化收獲已成為必然趨勢，而化學(xué)脫葉是棉花實(shí)現(xiàn)機(jī)械采收的核心配套技術(shù)[2]。

植物激素是調(diào)控葉片脫落的主要信號(hào)物質(zhì)。已有研究認(rèn)為乙烯及生長素是影響植物葉片脫落的關(guān)鍵植物激素[3]，乙烯能誘導(dǎo)纖維素酶等細(xì)胞壁水解酶基因的表達(dá)從而正向調(diào)控植物葉片脫落[4-5]，而離區(qū)部位的生長素可以通過鈍化離區(qū)細(xì)胞對乙烯的敏感性來阻止脫落的發(fā)生，但這需要生長素源源不斷地沿著自上而下（自葉片向葉柄）的方向進(jìn)行極性運(yùn)輸[6-7]。 脫落酸也可以促進(jìn)器官脫落，但這種作用是通過抑制生長素的傳導(dǎo)或刺激乙烯的產(chǎn)生而間接實(shí)現(xiàn)的[8]。

噻苯隆具細(xì)胞分裂素活性，屬于植物生長調(diào)節(jié)劑型（即激素活力類）脫葉劑，未發(fā)現(xiàn)其對葉片的直接傷害[9]；其作用機(jī)理主要是促進(jìn)葉片產(chǎn)生乙烯，同時(shí)抑制葉柄中生長素的極性運(yùn)輸，從而使離區(qū)細(xì)胞對乙烯更為敏感， 繼而誘導(dǎo)葉片脫落[10]。棉花葉片對噻苯隆的響應(yīng)速度與葉齡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)噻苯隆處理棉花葉片后，嫩葉和仍在伸展的葉片快速而完全脫落，而較老的葉片脫落較慢且不完全[11]。 乙烯誘導(dǎo)棉花葉片脫落時(shí)也存在類似現(xiàn)象， 即幼葉對乙烯較為敏感容易脫落，老葉則對乙烯的響應(yīng)比較遲鈍，不易脫落[12]。然而至今，不同葉齡葉片脫落的時(shí)序性與離層形成的時(shí)序性是否一致尚未可知。 此外，雖然有證據(jù)表明噻苯隆誘導(dǎo)葉片脫落的關(guān)鍵是刺激葉片產(chǎn)生乙烯，但尚不明確棉花不同葉齡葉片對噻苯隆響應(yīng)的差異是否與乙烯合成乃至乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)直接相關(guān)。

因此，本研究通過研究棉花不同葉齡葉片對噻苯隆的響應(yīng)特征和乙烯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)特征，深入了解噻苯隆誘導(dǎo)棉花葉片脫落的機(jī)理，旨在為完善棉花脫葉催熟技術(shù)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用棉花品種為欣試17，由河北省棉花種子工程技術(shù)研究中心提供。 所用98.3%噻苯隆（Thidiazuron，TDZ） 標(biāo)準(zhǔn)品由德國Dr.Ehrenstorfer 公司生產(chǎn)。

試驗(yàn)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)（北京）光照培養(yǎng)室進(jìn)行，棉花采用營養(yǎng)液培養(yǎng)。 培養(yǎng)室光溫條件為14 h（30±2）℃/10 h（22±2）℃，室內(nèi)相對濕度70%～80%，光照強(qiáng)度為600 μmol·m－2·s－1。浸種前用9%雙氧水消毒15 min， 沖洗數(shù)遍后置于裝有去離子水的燒杯中浸種12 h 以上至露白，播種于沙床中，待子葉完全展開后選取長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移至改良Hoagland 營養(yǎng)液中培養(yǎng)。 營養(yǎng)液配方為0.5 mmol·L－1NH4H2PO4，1.25 mmol·L－1K2SO4，2.5 mmol·L－1Ca（NO3）2·4H2O，1.0 mmol·L－1MgSO4·H2O，0.1 mmol·L－1EDTA·FeNa，2×10－2mmol·L－1H3BO3，1×10－3mmol·L－1ZnSO4·7H2O，1×10－3mmol·L－1MnSO4·H2O，2×10－4mmol·L－1CuSO4·5H2O，5×10－6mmol·L－1（NH4）6Mo7O24·4H2O。每3～4 d 更換1 次營養(yǎng)液，通氣泵每天24 h 通氣。

1.2 棉花不同葉位（葉齡）葉片對TDZ 的響應(yīng)

棉花培養(yǎng)至10 葉期用4.54 mmol·L－1TDZ均勻涂抹每一片主莖葉，以涂抹清水為對照。 重復(fù)3 次，每重復(fù)1 株。 每天進(jìn)行觀察拍照，并記錄不同葉位葉片離層形成及葉片脫落的順序。

1.3 乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)量測定

棉花培養(yǎng)至10 葉期用4.54 mmol·L－1TDZ均勻涂抹棉花功能葉倒4 葉與幼葉（倒1 葉），以涂抹清水為對照。 在處理后0、3、6、12、24 h 對功能葉及幼葉進(jìn)行取樣，設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為3 株植株的混樣。 用北京艾德萊公司生產(chǎn)的EASYspin 植物RNA 快速提取試劑盒提取RNA，Takara 公司的M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中GhACS1、GhACO1、GhEIN3 和GhERF 23 基因的CDS 序列設(shè)計(jì)qRT-PCR （Quantitative real-time polymerase chian reaction）特異性引物（表1），以Ghactin9 基因?yàn)閮?nèi)參。qRT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。 采用2－△△CT方法計(jì)算基因表達(dá)量[13]。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)， 用SPSS 21.0（IBM,USA）對結(jié)果進(jìn)行t 檢驗(yàn)（獨(dú)立樣本模型）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉位（葉齡）葉片對TDZ 的響應(yīng)

對10 葉期棉花所有主莖葉均勻涂抹4.54 mmol·L－1TDZ 后1 d， 棉株上部葉片與對照相比部分泛黃（圖1A）；4 d 后，處理葉片進(jìn)一步黃化，葉緣卷曲，幼葉已干枯、即將脫落，而對照與處理前相比無明顯變化 （圖1B）；6 d 后，處理葉片明顯干枯泛黃，葉緣嚴(yán)重卷曲，部分葉片葉柄開始變紅，葉片脫落，而對照組仍正常生長（圖1C）；9 d 后， 可以觀察到處理的大部分主莖葉已脫落，而果枝葉未受影響（圖1D）。

如圖2 所示，4.54 mmol·L－1TDZ 處理棉花主莖葉后，幼葉（倒1 葉）最早形成離層并脫落，其離層形成和脫落時(shí)間分別為處理后2 d 和4 d（圖2A，2D）；功能葉（倒4 葉）的離層形成時(shí)間為處理后6 d（圖2B），晚于幼葉和基部葉片（倒9-10葉）， 但離層形成后很快脫落 （處理后7 d，圖2E）；基部葉片的離層形成時(shí)間居中（處理后4 d，圖2F），但其葉片和葉柄于處理后6 d 逐漸泛黃、干枯，出現(xiàn)枯而不落的現(xiàn)象（圖2C）。

圖1 棉花主莖葉涂抹噻苯隆后的脫落動(dòng)態(tài)Fig. 1 Dynamics of leaf abscission after treated with thidiazuron

圖2 涂抹噻苯隆后棉花不同部位主莖葉的離層形成和脫落Fig. 2 Abscission zone formation and defoliationof different main stem leaves after treated with thidiazuron

2.2 TDZ 對不同葉片中與乙烯相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖3 噻苯隆對幼葉和功能葉中GhACS1、GhACO1、GhEIN3 和GhERF23 表達(dá)量的影響Fig. 3 Expression of GhACS1, GhACO1,GhEIN3 and GhERF23 in the youngest just expanded leaf and the youngest full-expanded leaf after thidiazuron treatment

本研究檢測了棉花幼葉和功能葉 （倒4 葉）中乙烯合成相關(guān)基因GhACS1 和GhACO1、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因GhEIN3 及乙烯響應(yīng)元件基因GhERF23 的表達(dá)量。 在幼葉中，TDZ 處理后3～24 h 期間GhACS1 的表達(dá)量均高于CK， 其中在6 h 和24 h 達(dá)到顯著水平 （圖3A）；GhACO1 和GhEIN3 表達(dá)量在處理后12 h 之前與CK 無顯著差異，但在處理后24 h 與CK 相比上調(diào)數(shù)倍（圖3C，3E）；GhERF23 基因的表達(dá)受TDZ 的顯著影響，在處理后24 h 內(nèi)持續(xù)上調(diào)，而CK 中該基因的表達(dá)量保持穩(wěn)定，TDZ 處理后3 h GhERF23 的表達(dá)量較CK 上調(diào)10 倍， 在處理后12～24 h 達(dá)40 倍（圖3G）。 在功能葉中，TDZ 處理后上述幾個(gè)基因未出現(xiàn)上調(diào)，僅GhACS1 的表達(dá)量在處理后12 及24 h 顯著高于CK，GhACO1 表達(dá)量在TDZ 處理后6 h 顯著低于CK（圖3B）。

3 討論

研究表明， 低濃度的乙烯可加速含羞草、番茄等植物較老葉片的脫落[14]。 但用乙烯熏蒸棉株后，頂端未展開或部分展開的幼葉會(huì)先于較老的葉片脫落[12]。棉花葉片對脫落劑TDZ 的響應(yīng)與乙烯類似，通常是剛剛展開的葉片以及頂端還未完全展開的葉片先脫落[10]。本研究結(jié)果與此相似。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，棉株不同葉位葉片的離層形成順序與脫落順序并不一致，主要表現(xiàn)為基部較老葉片的離層形成時(shí)間早于功能葉，但其脫落時(shí)間晚于功能葉，甚至發(fā)生“枯而不落”現(xiàn)象。 細(xì)胞壁水解酶是參與植物器官脫落的關(guān)鍵酶[15]，它可使離區(qū)中間層的細(xì)胞壁發(fā)生水解，促使植物器官脫落[16]，其活性受到乙烯的調(diào)控[17-18]。 我們推測棉花基部較老葉片經(jīng)TDZ 處理后， 在前期所產(chǎn)生的乙烯能夠誘導(dǎo)細(xì)胞壁水解酶合成和分泌，并導(dǎo)致離層形成，但后期乙烯水平可能不足以維持細(xì)胞壁水解酶的活性， 因而離層不能繼續(xù)降解，導(dǎo)致葉片枯而不落。

已知乙烯參與了TDZ 誘導(dǎo)的棉花葉片脫落[11]，乙烯合成抑制劑氨基乙基乙烯基甘氨酸能在一定程度上降低TDZ 的脫葉效果[19]，但是尚不明確乙烯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因是否也參與到該過程。 因此本研究從基因表達(dá)水平揭示了棉花不同葉位（葉齡）葉片對TDZ 響應(yīng)的差異。 1-氨基環(huán)丙烷羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC）合酶（1-Am-inocyclopropane-1-carboxylate synthase, ACS）和ACC 氧化酶（1 - Aminocyclopropane- 1- carboxylate oxidase,ACO）是催化乙烯生物合成的2 個(gè)關(guān)鍵酶，也是番茄和其他物種果實(shí)成熟研究的早期靶標(biāo)[20]。 敲除ACO 和ACS 基因能抑制乙烯的產(chǎn)生從而強(qiáng)烈抑制果實(shí)成熟過程[21]。 在乙烯誘導(dǎo)棉花葉片脫落過程中，也伴隨著ACC 合酶和ACC 氧化酶活性的增加[22]。 本研究發(fā)現(xiàn)，TDZ 處理后，幼葉中GhACS1 基因上調(diào)表達(dá)的時(shí)間早于功能葉；幼葉GhACO1 基因的表達(dá)在處理后24 h 顯著增加，而功能葉中該基因的表達(dá)在處理后24 h 內(nèi)與CK無顯著差異。 結(jié)果表明，TDZ 處理后幼葉中乙烯的合成要早于功能葉，這與其較功能葉更早形成離層并脫落相一致。

EIN3/EILs 在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用， 可與下游的乙烯響應(yīng)因子（Ethylene response factors, ERFs） 基因啟動(dòng)子上特定的DNA 序列結(jié)合，誘導(dǎo)ERFs 的表達(dá)[23]。 ERFs 是1類具有AP2 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，受脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的某些組分調(diào)節(jié)。 用乙烯、脫落酸、鹽、冷或干旱脅迫處理棉花，GhERF4 的轉(zhuǎn)錄水平大幅度提高[24]。 本研究發(fā)現(xiàn)，TDZ 處理后24 h，幼葉中GhEIN3 表達(dá)水平較CK 顯著增加4 倍，GhERF23 的表達(dá)水平在處理后3～24 h 均顯著高于CK；而在功能葉中GhEIN3 及GhERF23 的表達(dá)量在處理后24 h 之內(nèi)與CK 相比無顯著差異。 顯然，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在TDZ 誘導(dǎo)的棉花葉片脫落過程中也可能起著重要作用。 推測TDZ 首先通過誘導(dǎo)GhACS1 和GhACO1 的表達(dá)增加葉片乙烯釋放量，然后通過誘導(dǎo)GhEIN3（不排除其他因子） 和GhERF23 的表達(dá)向葉柄離層部位傳遞信號(hào)，引起離層部位與脫落相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)葉柄離層形成和葉片脫落。

綜上可見，棉花幼葉中與乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)對TDZ 響應(yīng)較早， 這可能是其經(jīng)TDZ 處理后脫落較快的重要原因。功能葉中乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因?qū)DZ 的響應(yīng)相對滯后或在24 h 之內(nèi)未響應(yīng)，可能是由于該葉位葉片已接近成熟，在基因表達(dá)及生理生化水平上對外源刺激有一定的緩沖能力。

近年來國內(nèi)外對脫葉劑的研究多集中在田間應(yīng)用方面， 對脫葉劑作用機(jī)理的研究相對較少，而深入揭示TDZ 促進(jìn)棉花葉片脫落的機(jī)制是完善機(jī)采棉脫葉催熟技術(shù)的基礎(chǔ)。 后續(xù)研究除葉片外要增加葉柄、離層等部位，除乙烯相關(guān)基因外要增加生長素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，除基因表達(dá)水平外還要檢測葉片的乙烯釋放量和生長素含量，此外要延長檢測時(shí)間。

4 結(jié)論

本研究揭示了棉花不同葉位葉片對噻苯?。═DZ）響應(yīng)的差異，基部老葉的離層形成較功能葉較早，但容易枯而不落。 幼葉的離層形成時(shí)間和脫落速度快于功能葉及基部葉片，可能與其乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因?qū)DZ 的響應(yīng)較早有關(guān)。