張愛，王彩香，宿俊吉，張先亮，史春輝，劉娟娟，彭云玲，馬雄風，4*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，蘭州730070；2.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/ 甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，蘭州730070；3.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，河南 安陽455000；4.鄭州大學農(nóng)學院，鄭州450001）

MADS-box 基因廣泛存在于植物、動物和真菌中， 所編碼的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子。 植物MADS-box 基因被分為Type Ⅰ型和MIKC 型兩類[1]。 Type Ⅰ型基因通常有1～2 個外顯子，編碼蛋白質(zhì)含高度保守的MADS 結構域， 依據(jù)MADS 結構域的差異進一步分為Mα、Mβ 和Mγ三類[2]。 MIKC 型基因有6～8 個外顯子，編碼蛋白包含MADS-box（M 結構域）、Intervening 結構域（I 結構域）、Keratin-like 結構域（K 結構域）和C 端結構域4 種保守結構域， 依據(jù)I 結構域的不同進一步分為MIKCC型和MIKC*型。 根據(jù)基因功能和序列特征差異，MIKCC型基因又可以分為14 個 亞 類：AGAMOUS-LIKE 17 （AGL17）、AGL15、AGL6、AGL12、SHORT VEGETATIVE PHASE （SVP）、SEPALLATA（SEP）、AGAMOUS（AG）、APETALA1 （AP1）、APETALA3/PISTILATA（AP3/PI）、GGM13 （BS）、FLOWERING LOCUSC（FLC）、TM8、TM3 和GpMADS4[3]，MIKC*型基因又分為P 類基因和S 類基因[4-6]。

在擬南芥、 水稻等模式植物的研究中發(fā)現(xiàn)，MADS-box 基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子能夠通過形成多聚復合體的方式參與植物生長發(fā)育的生命進程。 例如，Type Ⅰ基因AGL23 參與胚乳發(fā)育、雌配子體發(fā)育和葉綠體形成[7]，AGL62 基因在種子發(fā)育中起重要作用[8]。 MIKC 型基因FLC 是擬南芥春化的主要決定因素，AG 基因影響胚珠發(fā)育和花形態(tài)建成，SEP3 與生長素信號轉(zhuǎn)導有關[9-11]。此外，Zhang 等[12]在桃（Prunus persica）中發(fā)現(xiàn)PpMADS1 可以促進果實成熟，劉國琴等[13]發(fā)現(xiàn)梨（Pyrus pyrifolia white pear group）芽內(nèi)休眠的解除受PpMADS1 和PpMADS2 基因調(diào)控。 前人對MADS-box 基因的研究探索了其在植物生長發(fā)育中的作用機制， 驗證了其功能多樣化，也反映出MADS-box 基因在植物中的重要作用。

MADS-box 基因的編碼蛋白作為1 類重要轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控棉花開花和纖維生長等發(fā)育進程。 有研究認為，棉花MADS-box 基因與細胞的伸長相關， 這類基因可能參與赤霉素（Gibberellins，GAs）合成途徑，影響棉纖維伸長[14-15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，GhMADS22 可能具有促進棉花開花、延緩衰老、通過脫落酸（Abscisic acid，ABA）信號途徑提高植物對非生物脅迫抗性的作用[16]。另有研究證明，MADS-box 家族基因GhSOC1 能促使棉花提前開花，莖生葉數(shù)量增加，過表達該基因能使棉花花器官發(fā)生變異[17]。 陸地棉（Gossypium hirsutum L.）作為棉花4 大栽培種之一，其種植面積占棉花總種植面積90%以上[18]，研究陸地棉MADS-box 家族基因?qū)Ω牧缄懙孛拊缡煨?、纖維品質(zhì)等性狀具有重要意義。 周娜等[19]利用2015年最初完成的陸地棉參考基因組序列[20]，通過生物信息學方法鑒定到100 個陸地棉MIKCC基因， 并認為MIKCC基因可能受miRNA 調(diào)控，從而調(diào)控陸地棉生長發(fā)育。 Ren 等[21]也鑒定出110個MIKC 型基因， 通過遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥證明GhAGL17.9（MIKCC基因）正調(diào)控LFY 基因促進開花。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)目前MADS-box 基因家族的生物信息學研究主要集中于MIKC 型基因，而對于Type Ⅰ型基因研究很少。 本研究在前人基礎上， 利用2019 年最新組裝的陸地棉參考基因組[22]，從全基因組水平鑒定陸地棉Type Ⅰ型及MIKC 型MADS-box 家族全部基因，對該家族基因開展染色體定位、 多序列比對聚類分析、Motif 預測和基因結構鑒定等多方面研究， 并對該家族Type Ⅰ型及MIKC 型基因進行組織特異性表達分析，以期為棉花分子育種提供基因資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 陸地棉MADS-box 基因家族成員鑒定及染色體定位

陸地棉全基因組蛋白序列數(shù)據(jù)來自Cotton-FGD 網(wǎng)站[23]（https://cottonfgd.org/about/download.html），從Pfam 網(wǎng)站[24]（https://pfam.xfam.org/）下載MADS-box 家族HMM 模型文件SRF-TF（PF00319）和K-box（PF01486），使 用HMMER 3.0 軟件[25]鑒定陸地棉MADS-box 家族基因，閾值E＜1e－5。 利用Pfam 網(wǎng)站[24]（https://pfam.xfam.org/）和SMART 網(wǎng) 站[26]（http://smart.embl-heidelberg.de/） 進一步確認所鑒定MADS-box 基因編碼蛋白是否含有其保守結構域。從CottonFGD 網(wǎng)站[23]（https://cottonfgd.org/jbrowse/） 獲取陸地棉MADS-box 家族基因物理位置信息文件，利用軟件MapInspect（http://www.mybiosoftware.com/mapinspect-compare-display-linkage-maps.html）繪制基因在染色體上的位置圖。

1.2 系統(tǒng)進化樹構建分析

從TAIR 網(wǎng)站[27]（https://www.arabidopsis.org/）獲得擬南芥MADS-box 蛋白質(zhì)序列，通過基因組注釋信息 （http://rice.plantbiology.msu.edu/）[28]獲得水稻MADS-box 蛋白序列， 利用Pfam 網(wǎng)站[29]（https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/）確認所獲得擬南芥和水稻MADS-box 蛋白含有的結構域。 用ClustalW 將棉花MADS-box 蛋白序列與已經(jīng)分型的擬南芥和水稻MADS-box 蛋白進行序列比對分析，利用MEGA 7.0[30]構建系統(tǒng)進化樹，使用鄰近法（Neighbor-joining method），選擇成對刪除（Pairwise deletion），設置Bootstrap 值為1 000。

1.3 陸地棉MADS-box 家族保守基序（motif）預測及基因結構分析

使用MEME 在線工具[31]（http://meme-suite.org/） 進行motif 預測，motif 最大發(fā)現(xiàn)數(shù)設為5，利用浙江大學Gossypium new sequence data release 網(wǎng) 站 （http://ibi.zju.edu.cn/cotton/） 獲 取MADS-box 基因結構注釋gff3 文件。 運用TBtools[32]對motif 分析結果及基因結構分析結果進行可視化。

1.4 MADS-box 基因組織特異性表達分析

從NCBI SRA 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA248163） 獲得陸地棉標準系TM-1 根、莖、葉、花托、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣、花后5 d 纖維、花后10 d 纖維、花后20 d 纖維以及花后25 d 纖維12 個組織的RNA-seq 數(shù)據(jù)[20]。通過TopHat[33]和Cufflinks[33]比對到陸地棉基因組并組裝樣本轉(zhuǎn)錄本。通過計算標準化FPKM 值顯示基因的表達水平。 表達模式熱圖通過omicshare 網(wǎng) 站（https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/heatmap）呈現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 陸地棉MADS-box 家族基因鑒定

為了全面準確鑒定陸地棉MADS-box 家族基因，利用最新組裝的陸地棉參考基因組[22]，最終鑒定到陸地棉MADS-box 基因家族成員181 個，其中，Type Ⅰ基因占36.5%（66 個），MIKC 基因占63.5%（共115 個， 包括90 個MIKCC型和25個MIKC*型基因）（表1）。 運用CottonFGD 網(wǎng)站的信息， 分析MADS-box 基因理化性質(zhì)， 發(fā)現(xiàn)85%的Type Ⅰ型基因具有1～2 個外顯子，編碼蛋白質(zhì)最小包含74 個氨基酸殘基（GH_D06G0314）， 最 大 包 含593 個 氨 基 酸 殘 基（GH_A01G1960）；97%的MIKCC基因含有6～8個外顯子， 編碼蛋白質(zhì)長度從174 氨基酸殘 基 （GH_D03G0830） 到315 氨 基 酸 殘 基（GH_A08G1545）； 而MIKC*型基因的外顯子數(shù)目范圍較大（1～12），保守性相對較差，所編碼蛋白質(zhì)長度分布在63（GH_D04G0829）～373 氨基酸殘基（GH_D12G1969）。 分析顯示：相對TypeⅠ型和MIKC*型基因，MIKCC型基因外顯子數(shù)目及基因所編碼蛋白質(zhì)長度均比較保守。

2.2 MADS-box 基因在染色體上的位置

為了確定MADS-box 基因在陸地棉染色體上的分布，通過CottonFGD 網(wǎng)站獲得所鑒定181個MADS-box 基因的物理位置信息文件， 利用MapInspect 進行可視化展示，發(fā)現(xiàn)A 組染色體上分布78 個MADS-box 基因，D 組染色體上分布103 個，D 組染色體上分布的基因較多（圖1）。 進

一步分析發(fā)現(xiàn)， 除了A02、A07 和D07 染色體，Type Ⅰ型基因在其余23 條染色體上均有分布，其中染色體D13 上最多（8 個），在染色體A01、A03、A05、A06 和A10 上各有1 個。 MIKCC型基因在陸地棉26 條染色體上均勻分布， 其中在A01 和D01、A08 和D08、A09 和D09、A10 和D10 共4 對同源染色體上各有2 個MIKCC基因。MIKC*型基因分布于15 條染色體上，其中染色體D02 和D04 上分布最多，分別有4 個基因；A03、A05、A11 和D11 染色體上各有2 個MIKC*基 因；A02、A06、A07、A12、A13、D05、D06、D07 和D12 染色體上各含1 個MIKC*基因。

表1 陸地棉MADS-box 基因外顯子數(shù)量及蛋白質(zhì)長度Table 1 The Number of exons and protein length of MADS-box genes in upland cotton

圖1 MADS-box 基因在陸地棉染色體上的分布Fig. 1 Chromosomal distribution of MADS-box genes in upland cotton

2.3 多序列比對及進化分析

為了確定陸地棉MADS-box 基因同源進化關系，分別篩選100 個擬南芥MADS-box 蛋白序列（57 個Type Ⅰ型，43 個MIKC 型），71 個水稻MADS-box 蛋 白 序 列 （36 個Type I 型，35 個MIKC 型）（表2）。 使用MEGA 7.0 構建擬南芥、水稻和陸地棉Type I 型MADS-box 蛋白系統(tǒng)進化樹， 結果顯示陸地棉66 個Type I 型蛋白共被分為3 個亞家族，Mα、Mβ 和Mγ （表2 和圖2A）， 其中40 個Type I 為Mα 類，21 個為Mγ類，二者數(shù)量均大于擬南芥和水稻Mα 及Mγ 蛋白數(shù)量；而陸地棉Mβ 蛋白僅有5 個，少于擬南芥和水稻Mβ 類蛋白數(shù)量。 構建擬南芥、水稻和陸地棉MIKC 型MADS-box 蛋白系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)陸地棉MIKC 型蛋白包含MIKCC型10 個亞家族 （AGL17、AG、SVP、AGL15、BS、AP3/PI、SOC1、AP1、AGL6 和SEP）以及MIKC* 型（圖2B）。進一步比較發(fā)現(xiàn)， 擬南芥和水稻中分別有5 個和6個AP1 蛋白，而陸地棉中有11 個；對于AG 亞家族，擬南芥、水稻、陸地棉中成員數(shù)目分別是4、5和10 個；AP3/PI 亞家族中，擬南芥和水稻分別有2 個和3 個，而陸地棉有12 個該亞家族蛋白。 結果顯示，在AP1、AG、AP3/PI 亞家族中，陸地棉包含成員數(shù)量均超過擬南芥和水稻。 此外，陸地棉中與開花時間相關的SVP、AGL17、AGL6 亞家族成員數(shù)量是水稻或擬南芥蛋白數(shù)量的2 倍多；且在陸地棉中未發(fā)現(xiàn)FLC 蛋白，該類蛋白在擬南芥春化開花調(diào)控途徑中起關鍵作用（表2 和圖2B）。

表2 擬南芥、水稻和陸地棉MADS-box 蛋白質(zhì)數(shù)目比較Table 2 Comparison of MADS-box proteins number in Arabidopsis, rice and upland cotton

2.4 MADS-box 家族成員保守基序（motif）預測及基因結構分析

為了確定MADS-box 基因編碼蛋白所含基序，通過MEME 在線工具預測分析發(fā)現(xiàn)，Type Ⅰ型66 個基因所編碼蛋白均含有MADS 結構域（motif 2）（圖3A）。 MIKC 型基因編碼蛋白中，90個MIKCC蛋白均含有MADS 結構域（motif b）和K 結構域（motif e）（圖3B）；25 個MIKC* 型蛋白均含有MADS 結構域（motif 7），含有K 結構域（motif 10）的有22 個（圖3C）。 綜上，通過保守基序分析可知，在MADS-box 家族中，所有成員均具有MADS 結構域，K 結構域僅在MIKC 類蛋白中存在，MADS-box 家族蛋白I 結構域和C 結構域的序列長度及結構保守程度較低。

圖2 擬南芥、水稻、陸地棉MADS-box 家族成員的系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of members of MADS-box family in Arabidopsis, rice and upland cotton

圖3 陸地棉MADS-box 蛋白motif 預測結果Fig. 3 Motif prediction results of MADS-box proteins in upland cotton

分析MADS-box 家族基因結構發(fā)現(xiàn)：TypeⅠ型基因中GH_D04G0827、GH_D02G1381、GH_D06G0900、GH_A13G0811 和GH_D13G0779 包含8 ～12 個 外 顯 子，GH_D13G1667 、GH_D13G1333、GH_D13G0907、GH_D02G2153 和GH_D12G1194 分布3～4 個外顯子， 其余56 個Type Ⅰ型基因均有1～2 個外顯子（45 個基因含有1 個外顯子，11 個基因含有2 個外顯子）（圖4A）；而MIKC 型基因中，同一亞家族成員外顯子結構和數(shù)量具有相似性， 例如，SEP、AGL6、AG和AP1 亞族的大多數(shù)成員均含有8 個外顯子，SOC1 和AP3/PI 基因含有7 個外顯子，BS 基因含有6 個外顯子（圖4B）。 基因長度分析結果顯示，Type Ⅰ型基因均未超過5 000 bp （base pair,堿基對）；MIKC 型基因中， 基因長度是各亞族間最明顯的區(qū)別，例如：SEP 和MIKC* 類基因長度均不超過5 000 bp，AGL17 類基因中8 個基因的長度超過13 000 bp。 上述結果表明，Type Ⅰ型基因的外顯子數(shù)目和基因長度均小于MIKCC型基因。

圖4 陸地棉MADS-box 基因結構Fig. 4 Gene structure of MADS-box genes in upland cotton

2.5 陸地棉MADS-box 基因組織特異性表達分析

根據(jù)基因表達分析結果可將Type Ⅰ型MADS-box 基因分為8 類。 第1 類基因在莖、葉、花托中表達， 第3、8 類基因主要在纖維中表達，第2、4、5、6、7 類基因分別在萼片、雌蕊、根、雄蕊和花瓣中高水平表達（圖5A）。

MIKC 型基因根據(jù)表達分析結果可分為10類，分別在纖維（第1、2 類基因）、花器官（第3、4、6、7、9 和10 類）、根和莖（第5、8 類基因）中表達量較高，而葉中的表達水平很低（圖5B）。 對各組織中所表達基因進一步分析發(fā)現(xiàn)，有4 個AG 基因（GH_A05G2521、GH_A05G2747、GH_D05G2764和GH_D05G2543）在纖維中特異表達。 1 個AP1基因（GH_D03G1119）和1 個AGL6 基因（GH_D07G1573）僅在萼片中表達，3 個SVP 基因（GH_A06G0328、GH_A12G1017 和GH_D12G0863）在花托中優(yōu)勢表達，此外，有5 個基因在雄蕊中特異表達， 包括4 個MIKC* 基因、1 個AP3/PI 基因。 有3 個SOC1 基因和3 個AGL17 基因在莖中表達量較高。綜上，MIKC 型基因主要在陸地棉花器官和纖維各發(fā)育階段表達。

3 討論

MADS-box 家族基因編碼蛋白是植物生長發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子。 隨著多物種基因組測序完成，在擬南芥[34-35]、水稻[36-37]、小麥[38]、大豆[39]、番茄[40]、甘藍[41]、葡萄[42]、向日葵[43]和銀杏[3]等多種植物中對該家族基因進行了相關報道。 本研究利用最新組裝的陸地棉參考基因組數(shù)據(jù)[22]，通過生物信息學方法鑒定出181 個陸地棉MADS-box家族基因（66 個Type Ⅰ型，115 個MIKC 型）。前期Ren 等[21]鑒定到110 個陸地棉MIKC 型基因，分布于25 條染色體， 染色體D01 上無MIKC 型基因分布。 我們的研究結果鑒定出115 個MIKC型基因，分布于陸地棉26 條染色體上，其中D01染色體上有2 個MIKCC基因（GH_D01G1353 和GH_D01G2157）； 鑒定出66 個Type Ⅰ型基因，分布于23 條染色體上， 鑒定結果不同可能與所使用參考基因組有關。

通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉中與花形態(tài)建成相關基因（如：AG 和AP3/PI）、開花時間相關基因（如：SVP、AGL17 和AGL6）超過擬南芥或水稻相同亞家族基因數(shù)目的2 倍，這可能是由于陸地棉基因組較大[44-45]，而擬南芥和水稻基因組較小[46-50]造成的。 我們推測陸地棉MADS-box 基因在調(diào)控開花進程中，比擬南芥和水稻更加精細而復雜。 FLC 是MADS-box 基因所編碼蛋白，是1個開花抑制因子，高水平表達可抑制開花，低溫負調(diào)控FLC 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平促進植物開花[51]。分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉缺失FLC 基因，這與前人研究結果一致[52]，可能與陸地棉開花不需要春化有關。 此外，本次鑒定也未發(fā)現(xiàn)陸地棉AGL12 類基因， 且擬南芥與水稻的AGL12 基因均與陸地棉AP1 基因聚到1 個亞家族，這與前期Ren 等[21]的研究結果（陸地棉有2 個AGL12 基因）不同，可能與所使用參考基因組有關。

根據(jù)前人報道，MADS-box 基因參與雌配子體發(fā)育[7]、種子發(fā)育[53]、胚及胚乳發(fā)育[8]、控制雄蕊及花瓣發(fā)育[54]、心皮形態(tài)建成[55]、與不同物種間生殖器官分界決定有關[56]，并且與棉花纖維細胞伸長有關[14-15]。 通過組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉MADS-box 基因在花器官和纖維中高水平表達， 例 如：Type Ⅰ型 基 因 中GH_D05G2910、GH_D09G1491 和GH_D02G2551 在纖維發(fā)育初期特異性表達，GH_A08G2258、GH_D06G1276、GH_D06G1275、GH_D10G1756 在纖維發(fā)育后期特異表達。MIKC 基因中AP3/PI 基因主要在花器官中表達，AP1 基因主要在萼片中表達，AG 基因主要在纖維中高水平表達，BS 和AGL15 類基因均可在纖維中被發(fā)現(xiàn)，這些基因可能參與陸地棉開花和纖維發(fā)育調(diào)控，具體功能還需通過遺傳轉(zhuǎn)化等進一步研究。

圖5 MADS-box 基因在陸地棉不同組織中的表達分析Fig. 5 Expression analysis of MADS-box genes from different tissues in upland cotton

4 結論

通過生物信息學方法，鑒定了181 個陸地棉MADS-box 家族基因，包括Type Ⅰ和MIKC 型2大類基因。 染色體定位結果顯示，Type Ⅰ基因分布于陸地棉23 條染色體，MIKC 型基因分布在陸地棉26 條染色體上。 聚類分析發(fā)現(xiàn)， 陸地棉Type I 型蛋白分為3 個亞家族，MIKC 型蛋白包括MIKCC型 （包含10 個亞家族） 以及MIKC*型。Motif 預測結果顯示，陸地棉MADS-box 蛋白均含有MADS 結構域。 基因結構分析可知，MADS-box 基因外顯子和內(nèi)含子結構及長度在同一亞家族內(nèi)具有相似性。 組織特異性表達分析顯示，12 個組織中均有Type Ⅰ型基因參與表達，MIKC 基因主要在陸地棉花器官和纖維各發(fā)育階段表達量較高。對陸地棉MADS-box 家族的生物信息學分析，為了解陸地棉開花和纖維發(fā)育的基因組學研究提供了有益的借鑒，對于揭示棉花纖維品質(zhì)等重要性狀的遺傳調(diào)控機制及分子育種具有一定的理論意義和應用價值。