曙紅Y與乳酸環(huán)丙沙星相互作用的分光光度法研究及應(yīng)用

李華岑 朱雷 李娜 邱富娜/河南省獸藥飼料監(jiān)察所 450008

乳酸環(huán)丙沙星(CFLX)適用于敏感細(xì)菌及支原體所致畜禽及小動(dòng)物的各種感染性疾病。主要用于雞的慢性呼吸道病、大腸桿菌病、傳染性鼻炎、禽巴氏桿菌病、禽傷寒、葡萄球菌病，仔豬黃痢、仔豬白痢等。目前對(duì)乳酸環(huán)丙沙星的檢測(cè)方法主要有滴定法和高效液相色譜法。本文進(jìn)行了曙紅Y(EY)與乳酸環(huán)丙沙星相互作用的分光光度法研究，建立了曙紅Y測(cè)定乳酸環(huán)丙沙星的新方法，用于乳酸環(huán)丙沙星可溶性粉中乳酸環(huán)丙沙星含量的測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑PE公司lamda35型雙光束紫外光譜儀；BT 224S分析天平（Sartorius公司）；乳酸環(huán)丙沙星(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)H0141706，含量99.5%)：65.2mg·L-1；5.0×10-4mol·L-1曙紅Y溶液；0.01%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液；0.1%十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）；0.1%十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）；乳酸環(huán)丙沙星可溶性粉（河南健達(dá)獸藥有限公司，批號(hào)為JD190714，規(guī)格：按環(huán)丙沙星計(jì)10%）；所用水為純化水；其它試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法在10mL容量瓶中依次加入1.00mL曙紅Y溶液、適量乳酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)液、1.0mL 0.01% PVP溶液，加0.1mol/L鹽酸0.6mL，用水稀釋至刻度，搖勻，以水為參比立即進(jìn)行光譜掃描或固定波長(zhǎng)為536nm進(jìn)行吸光度測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜以水為空白，對(duì)體系進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，乳酸環(huán)丙沙星(13mg·L-1)最大吸收峰在277nm，曙紅B(5.0×10-5mol.L-1)可見(jiàn)區(qū)最大吸收峰在516nm，加入乳酸環(huán)丙沙星后體系在可見(jiàn)區(qū)的最大吸收紅移到536nm，紅移20nm，且吸光度明顯增加。說(shuō)明體系中應(yīng)該有乳酸環(huán)丙沙星與曙紅Y的復(fù)合物生成。

圖1 吸收光譜

2.2 酸度對(duì)體系的影響在10mL容量瓶中，依次加入1.00mL曙紅Y溶液、3.0mL乳酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用1、0.1、0.01、0.001mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，以水為參比立即進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.01mol/L鹽酸稀釋后體系最大吸收波長(zhǎng)紅移最大。隨后考察了0.1mol/L鹽酸加入體積的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體系中加入0.4～0.8mL 0.1mol/L鹽酸時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)紅移波長(zhǎng)最大、紅移波長(zhǎng)數(shù)穩(wěn)定、在536nm波長(zhǎng)處體系和曙紅Y吸光度的差值最大，選擇0.1mol/L鹽酸加入量為0.6mL。

2.3 體系吸光度的穩(wěn)定性體系的吸光度隨時(shí)間減小，10min后溶液變渾濁并慢慢產(chǎn)出沉淀，為了提高體系的穩(wěn)定性考察了非離子表面活性劑對(duì)吸光度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入0.01% PVP 1.0mL后體系不再發(fā)生渾濁、吸光度非常緩慢的變小，1h內(nèi)體系吸光度僅減小3%。為提高測(cè)定準(zhǔn)確性，選擇體系混勻后立即測(cè)定。

2.4 最大結(jié)合數(shù)的測(cè)定固定乳酸環(huán)丙沙星濃度為1.55×10-5mol.L-1，改變曙紅Y的濃度，以相應(yīng)的試劑空白為參比測(cè)定體系的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以n(cEY/cCFLX)為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，n=1時(shí)出現(xiàn)一明顯折點(diǎn)。依據(jù)摩爾比法原理，乳酸環(huán)丙沙星與曙紅Y的最大結(jié)合數(shù)為1。

圖2 摩爾比法

圖3 吸收光譜圖

2.5 離子強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)用NaCl溶液考察了離子強(qiáng)度對(duì)體系的影響。發(fā)現(xiàn)，體系中加入NaCl后，體系中NaCl濃度為0.02～0.1mol.L-1時(shí)，吸光度隨NaCl濃度增大而緩慢變小。吸光度變小，表明乳酸環(huán)丙沙星與曙紅Y可能主要通過(guò)靜電引力結(jié)合。

2.6 表面活性劑的影響及反應(yīng)機(jī)理探討加入0.01% PVP 1.0mL，體系吸光度有一定的增大。加入陰離子表面活性劑0.1% SDBS 1.0mL，體系的吸光度幾乎完全猝滅。加入陽(yáng)離子表面活性劑0.1% CTMAB 0.05mL，體系的吸光度顯著增大。

非離子表面活性劑PVP的存在可能會(huì)聚集體系中CFLX與EY的復(fù)合物，形成膠束增敏體系使體系的吸光度增大。

對(duì)EY中加入CFLX和CTMAB的體系進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，CFLX(13mg·L-1)與CTMAB(5mg·L-1)的加入均能使EY(5.0×10-5mol.L-1)的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，推測(cè)CFLX、CTMAB與EY的結(jié)合方式是相似的。CTMAB與EY的結(jié)合可能主要是CTMAB分子中的季銨N＋正電荷與EY分子中的羧酸基－COO－負(fù)電荷間的作用。CFLX分子中有仲胺和叔胺，在酸性條件下，容易形成季銨N＋正電荷，可以和EY分子中的羧酸基－COO－負(fù)電荷結(jié)合生成離子復(fù)合物(CFLX和EY分子結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖4)。

圖4 乳酸環(huán)丙沙星與曙紅Y的分子結(jié)構(gòu)圖

體系中加入不同濃度SDBS的吸收光譜見(jiàn)圖5，由圖可知：隨著SDBS濃度的增大，體系最大吸收波長(zhǎng)由533nm變?yōu)?13nm。大量SDBS(100mg·L-1)的存在會(huì)抑制EY與CFLX復(fù)合物的形成，因?yàn)殪o電引力是一種非定向性的作用力，在大量SDBS陰離子的存在下，CFLX大部分可能會(huì)與SDBS結(jié)合，生成CFLX與SDBS的復(fù)合物，從而抑制CFLX與EY復(fù)合物的生成，而CFLX與SDBS的復(fù)合物在536nm沒(méi)有吸收或有很弱的吸收，從而使體系的吸光度產(chǎn)生嚴(yán)重猝滅。

圖5 吸收光譜圖

因而，推測(cè)乳酸環(huán)丙沙星與曙紅Y主要通過(guò)靜電引力結(jié)合，形成結(jié)合比為1:1的離子復(fù)合物。

2.7 線性范圍、檢出限和精密度乳酸環(huán)丙沙星在1.3～19.6mg·L-1濃度范圍內(nèi)服從比爾定律；回歸方程為：A=0.0204c(mg·L-1)+0.3213，相關(guān)系數(shù)為0.9958。按cL=3S/K得方法檢出限為0.3mg·L-1。對(duì)濃度為13mg·L-1的乳酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行平行測(cè)定求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝1.0%(n=6)。

2.8 樣品測(cè)定

精密稱取樣品乳酸環(huán)丙沙星可溶性粉約0.25g，置50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取5mL置50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。取適量供試品溶液按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳酸環(huán)丙沙星可溶性粉的測(cè)定和回收(n=6)