溫州蜜柑成花基因保守片段克隆與生物信息學(xué)分析

黃 貝 王 鵬 吳韶輝 溫明霞 柯甫志 徐建國

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州 318020）

柑橘是我國栽培面積最廣、經(jīng)濟(jì)地位最重要的果樹之一。溫州蜜柑是柑橘中品質(zhì)優(yōu)良，栽培廣泛的一個(gè)品種，據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局和浙江省業(yè)務(wù)部門數(shù)據(jù)顯示，2017年溫州蜜柑在浙江省種植面積達(dá)到4.99萬hm2，占柑橘類水果種植面積的52%左右[1]。隨著市場競爭壓力加大，提高主栽品種溫州蜜柑的產(chǎn)量和質(zhì)量顯得極為重要，而花芽分化時(shí)間、成花質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到果品的成熟和上市時(shí)間[2]。

形成花芽是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志[3]，柑橘可以通過砧木嫁接的方式打破物候期，接穗提早進(jìn)入成熟期。除此，植物花芽分化還受多種內(nèi)外因子的影響，內(nèi)在因子包括樹體C/N代謝、內(nèi)源激素，外在因子包括外施激素、多胺、多效唑，環(huán)境水份、溫度和外在脅迫的控制，但究其根本，都是內(nèi)外環(huán)境變化對(duì)成花基因的表達(dá)（上調(diào)或者下調(diào)）的干擾，從而出現(xiàn)決定性的影響。Bohlenius H.2006年提出樹木中的成花是受到CO/FT（CONSTANS/FLOWERING LOCUS T）基因相互表達(dá)共同調(diào)控的[4]，F(xiàn)T基因也被認(rèn)為是成花素的一個(gè)重要組成部分；Nishikawa F.發(fā)現(xiàn)柑橘FT基因的表達(dá)水平與柑橘花芽分化的形成和完全具有很好的相關(guān)性[5]。而轉(zhuǎn)錄因子FLC（FLOWERING LOCUS C）是決定能否順利成花的重要基因，研究發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境下，F(xiàn)LC抑制FT的表達(dá)，能避免溫度過低造成花芽傷害，從而形成遲花現(xiàn)象[6]。另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子GI（GIGANTEA）對(duì)CO和FT的表達(dá)都具有促進(jìn)作用，并且該因子對(duì)干旱脅迫有干旱逃避反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)使植株干旱條件下存活時(shí)間更長并促進(jìn)開花的關(guān)鍵因子FT和CO提前表達(dá)[7]。GI，CO，F(xiàn)T，F(xiàn)LC基因主要在葉片中協(xié)同表達(dá)產(chǎn)生“成花素”，進(jìn)而影響分生組織的SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1)，AP1（APETALA），F(xiàn)D，LEAFY基因表達(dá)，如圖1[8]。FT產(chǎn)生的“成花素”蛋白與莖尖分生組織的轉(zhuǎn)錄因子鋅指結(jié)構(gòu)蛋白FD結(jié)合，形成FT-FD復(fù)合結(jié)構(gòu)，在鹽脅迫情況下調(diào)控植株為延遲開花[9]。FT-FD蛋白復(fù)合體進(jìn)而促進(jìn)SOC1的表達(dá)，同時(shí)刺激和開花直接相關(guān)的AP1基因，SOC1和AP1都促進(jìn)植物花芽形成。LEAFY是另一個(gè)被證明和植物開花直接相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)化上保守，并在成花過程起關(guān)鍵性作用，也是調(diào)節(jié)逆境和植物疾病的關(guān)鍵因子之一[10]。因此，為促進(jìn)溫州蜜柑成花，提高花芽質(zhì)量，克隆溫州蜜柑調(diào)控成花轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)重要且迫切的分子研究基礎(chǔ)，檢測成花途徑上基因的表達(dá)情況可以快速地反映促進(jìn)花芽分化手段的優(yōu)劣性，及時(shí)調(diào)整處理方案。本研究以溫州蜜柑嫩梢為材料，集中克隆了8條成花調(diào)控因子的保守片段，片段長度較長，完整度高，可以作為定量PCR的模板設(shè)計(jì)引物，也可以作為RACE的模板，進(jìn)一步獲取全長片段，做下一步的功能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

圖1 溫州蜜柑花芽分化模型[10-12]

以5年生溫州蜜柑-由良（浙江省柑橘研究所種質(zhì)資源苗圃）為實(shí)驗(yàn)材料，采取長勢良好一致的嫩梢部位，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TransZol Up Plus RNA Kit（Code#ER 501)RNA提取試劑盒（全式金生物公司，北京），TransScriptII All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR(Code#A H321)普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金生物公司，北京）；DNA Marker 2000bp（艾德萊生物公司，北京）。KOD FX Neo高保真DNA聚合酶（TOYOBO株式會(huì)社，日本東京），DNA片段膠回收試劑盒（艾德萊生物公司，北京），瓊脂糖（生工公司，上海），其他均來自國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 RNA的提取

植物樣品經(jīng)液氮研磨后，用TransZolUp Plus RNA Kit進(jìn)行RNA提取，使用Nanodrop 2.0測定RNA濃度，取2μL RNA使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

2.2 cDNA第一條鏈合成

室溫條件下，在200μLPCR管中加入以下組分 ：1μ g 總 RNA，4μL5 x TransScript II All-in-One SuperMix for PCR，RNase-free水補(bǔ)足20μL。輕柔混勻，25℃孵育10min，50℃孵育30min，85℃加熱5s失活TransScript II。測定反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度，分裝兩管-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 溫州蜜柑成花基因核心序列的克隆

由于登陸的柑橘屬成花基因并不豐富，因而以NCBI上登陸的柑橘屬（Citrus sinensis,Citrus unshiu,Poncirus trifoliata）同源cDNA為模板，結(jié)合甜橙基因組數(shù)據(jù)庫序列信息，用Premier Primer軟件設(shè)計(jì)特異性引物獲取核心基因，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，將目的條帶回收，引物見表1。采用TOYOBO公司高保真酶KOD FX Neo，PCR反應(yīng)體系如下：2 x PCR Buffer for KOD FX Neo 25μL，2mM dNTPs 10 μ L，KOD FX Neo 1 μ L，Primer1 1 μ L，Primer21 μ L，cDNA 200 ng，ddH2O up to 50μL。反應(yīng)條件如下：94°預(yù)變性2min，98°變性10s，退火30s，68°延伸30s/kb，30個(gè)循環(huán)，68°后延伸10min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，連接到克隆載體pEASY blunt zero進(jìn)行測序。

表3 溫州蜜柑成花基因PCR特異性引物

圖2 ：溫州蜜柑嫩梢RNA電泳圖

圖3 CuFT1，CuFT3，CuAP1，CuSOC1，CuFLC，CuGI，CuCO，CuLEAFY電泳膠圖

2.4 成花基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線軟件Conseyveb.Domain Seaycn Seyvice分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。確定克隆的序列具有基因功能結(jié)構(gòu)，結(jié)合NCBI nucleotide blast其他物種核酸序列，下載多個(gè)不同植物成花基因，利用 MEGA 6軟件的Neighbor Joining(NJ)模型進(jìn)行 500次Bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，并構(gòu)建基因（FT1，F(xiàn)T3，AP1，SOC1，F(xiàn)LC，GI，CO，LEAFY）的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA的提取

嫩梢提取RNA28S和18S條帶清晰（圖2），NanoDrop2.0檢驗(yàn)OD260/280和 OD260/230均在2.0左右，說明沒有鹽、巰基、胍等其他雜質(zhì)污染，RNA的純度和完整性都較好，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

3.2 溫州蜜柑成花基因保守區(qū)克隆與序列分析

根據(jù)NCBI和甜橙基因組數(shù)據(jù)庫的序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取目標(biāo)序列。經(jīng)測序，將比對(duì)正確的序列命名為CuFT1，CuFT3，CuAP1，CuSOC1，CuFLC，CuGI，CuCO，CuLEAFY。其中，CuFT1保守區(qū)域的長度為557bp，CuFT3保守區(qū)域的長度為766bp，CuAP1保守區(qū)域的長度為699bp，CuSOC1保守區(qū)域的長度為1044bp，CuFLC保守區(qū)域的長度為805bp，CuGI保守區(qū)域的長度為981bp，CuCO保守區(qū)域的長度為1052bp，LEAFY保守區(qū)域的長度為1009bp，電泳結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過NCBI保守區(qū)域結(jié)構(gòu)預(yù)測（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），預(yù)測結(jié)構(gòu)如圖4所示。目的基因都包含其他物種該基因的保守結(jié)構(gòu)域，CuFT1和CuFT3序列包含PBP結(jié)構(gòu)域；CuAP1序列包含特有的K-box結(jié)構(gòu)域和MADS結(jié)構(gòu)域；CuCO序列包含COTANGS基因特有的CCT superfamily結(jié)構(gòu)域；CuSOC1序列包含K-box結(jié)構(gòu)域和MADS結(jié)構(gòu)域；克隆的成花基因片段與甜橙，萊蒙登陸的成花基因具有相同的特有結(jié)構(gòu)域。CuGI與登陸的萊蒙和甜橙GI cDNA序列比對(duì)率高達(dá)99%以上，如圖4所示。因此，推斷克隆出來的保守序列都是具有基因功能的片段。以本研究克隆的序列為模板，設(shè)計(jì)特異性引物可以檢測在不同時(shí)空處理下開花調(diào)控基因表達(dá)量的差異，可以為研究柑橘花芽分化的研究人員提供簡潔序列參考，極大地縮短序列驗(yàn)證時(shí)間。

圖4 克隆基因和基因家族共有保守區(qū)域

圖5 溫州蜜柑成花基因和其他物種成花基因進(jìn)化樹

3.3 溫州蜜柑成花基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將通過NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的其它物種的成花基因(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)與克隆序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。如圖5所示，溫州蜜柑成花基因與柑橘屬植物甜橙、萊蒙、枳具有非常高的同源性，在同一個(gè)進(jìn)化分支上，親緣性最高，具體物種名稱見圖5注示。

4 結(jié)論與討論

溫州蜜柑品種全、質(zhì)量品質(zhì)優(yōu)上，早中晚成熟期覆蓋面，是中國占比最高的主栽品種，因而提高其產(chǎn)量和質(zhì)量顯得極為重要?；ㄑ糠只瘯r(shí)間和成花質(zhì)量是保證果品質(zhì)量與成熟期的前提，因而研究溫州蜜柑的開花是一項(xiàng)基礎(chǔ)且重要的工作。本研究通過克隆成花基因序列以及分析發(fā)現(xiàn)，溫州蜜柑和同屬的柑橘類果樹基因保守性較高，部分位點(diǎn)有差異。本次實(shí)驗(yàn)測序驗(yàn)證正確的溫州蜜柑為后續(xù)開花調(diào)控，包括促成栽培、延后栽培、分析成花數(shù)量與質(zhì)量都有重要的實(shí)際意義。