田鶴　王雅光　閻文柱　穆長征

[摘要] 目的 研究小檗堿對糖尿病小鼠腎組織中NLRP3炎癥小體活化的影響，探討小檗堿保護糖尿病小鼠腎功能的作用機制。 方法 髙脂高糖飲食喂養(yǎng)后注射鏈脲佐菌素，建立糖尿病腎病小鼠模型。成模小鼠隨機分為糖尿病腎病組（DN）和小檗堿治療組（BBR），每組10只。另取10只小鼠作為正常對照組（Control）。動態(tài)檢測小鼠的血糖和尿蛋白。小鼠飼養(yǎng)6個月后取材腎，通過HE染色觀察腎組織病理變化，應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)和免疫印跡技術(shù)檢測小檗堿對NLRP3表達的影響。 結(jié)果 糖尿病腎病組小鼠血糖和尿蛋白持續(xù)升高，各時間點與Control組比較均差異顯著（P<0.01），4～24周，小檗堿治療組降低血糖和尿蛋白，與DN組比較差異顯著（P<0.05或P<0.01）。糖尿病腎病組小鼠腎小體腫大，腎小管上皮細胞空泡樣改變，小檗堿可明顯減輕高糖造成的病理損害。免疫組織化學和免疫印跡檢測結(jié)果證實小檗堿抑制NLRP3的表達。 結(jié)論 小檗堿通過抑制NLRP3炎癥小體的活化改善糖尿病腎病癥狀。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎病;小檗堿;NLRP3;炎癥小體

[中圖分類號] R392 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）23-0034-04

Experimental study of berberine in improving diabetic renal function by regulating NLRP3 inflammasome activation

TIAN He ? WANG Yaguang ? YAN Wenzhu ? MU Changzheng

School of Basic Medicine， Jinzhou Medical University， Jinzhou ? 121001， China

[Abstract] Objective To study the effect of berberine on the activation of NLRP3 inflammasomes in the kidney tissue of diabetic mice， and to explore the mechanism of berberine in protecting the renal function of diabetic mice. Methods A mouse model of diabetic nephropathy was established by injecting streptozotocin after high-fat high-sugar diet. The model mice were randomly divided into Diabetic nephropathy（DN） group and Berberine（BBR） group， with 10 mice in each group. Another 10 mice were taken as normal control group. The blood glucose and urine protein in mice were dynamically detected. The kidneys were taken from the mice after 6 months of rearing， and the pathological changes of the kidney tissues were observed by HE staining. The effect of berberine on the expression of NLRP3 was detected by immunohistochemistry and western blotting. Results In the DN group，the blood glucose and urine protein of mice continued to increase， and there were significant differences between the DN group and the control group at each time point（P<0.01）. 4 weeks to 24 weeks， compared with the DN group， Berberine group reduced blood glucose and urine protein （P<0.05 or P<0.01）. The renal corpuscles of diabetic mice were enlarged， and the renal tubular epithelial cells had vacuole-like changes. Berberine can significantly reduce the pathological damage caused by high glucose. The results of immunohistochemistry and western blotting confirmed that berberine inhibited the expression of NLRP3. Conclusion Berberine can improve the symptoms of diabetic nephropathy by inhibiting the activation of NLRP3 inflammasome.

[Key words] Diabetic nephropathy; Berberine; NLRP3; Inflammasome

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿?。―iabetes mellitus，DM）最為嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病（End-stage renal disease，ESRD）和DM患者死亡的主要原因[1]。糖尿病腎病的發(fā)病機制至今不明，尚無有效的治療手段。越來越多的證據(jù)表明高血糖生成的糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）及其受體（Receptor for advanced glycation end products，RAGEs）相互作用，產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終導致糖尿病患者腎組織結(jié)構(gòu)的逐步破壞和腎功能的進行性下降[2，3]。NLRP3（NOD-like receptor family，pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)db/db糖尿病小鼠血清中IL-1β和IL-18的含量明顯高于野生小鼠，同時在其腎組織中檢測到NLRP3的表達顯著增加[4]。

小檗堿是中藥黃連的主要成分，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病及糖尿病等慢性病的治療，具有降血糖、抗炎以及清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物等作用。但是小檗堿是否影響糖尿病腎組織中的NLRP3炎癥小體的活化，報道較少。為此，本研究通過建立糖尿病腎病小鼠模型，應(yīng)用HE染色、免疫組織化學染色和免疫印跡技術(shù)檢測小檗堿對糖尿病小鼠腎組織形態(tài)功能的影響及對NLRP3炎癥小體表達的影響，從而驗證小檗堿通過抑制NLRP3炎癥小體活化進而改善糖尿病腎病的實驗假說，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57小鼠，雄性，30只，購于北京維通利華實驗動物中心[SCXK（京）2016-0006]，飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 實驗試劑

鏈脲佐菌素粉末（Sigma公司S0130）;NLRP3單克隆抗體（Sigma公司HPA012878）;免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司SAP9100）、DAB顯色試劑（北京中杉金橋公司ZLI9017）;PVDF膜（碧云天公司FFP24）;ECL發(fā)光液（碧云天公司P0018AS）。

1.3 糖尿病腎病模型建立及分組

高糖高脂飲食喂養(yǎng)C57小鼠1個月，禁食12 h，腹腔注射1%STZ溶液（55 mg/kg），間隔1 d再次注射。STZ以0.5 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。小鼠代謝籠內(nèi)喂養(yǎng)。若血糖值>16.7 mmol/L，尿量﹥原尿量150%，尿蛋白>30 mg/（kg·24 h），則小鼠符合糖尿病腎病模型標準[5]。成模的小鼠隨機分為糖尿病腎病組（DN）及小檗堿治療組（BBR），隨時補充死亡的小鼠，保證每組10只小鼠納入統(tǒng)計分析。另設(shè)10只小鼠為正常對照組（Control）。BBR組小鼠灌胃給藥，給藥劑量為0.1 g/kg，間隔24 h灌胃一次。C組和DN組小鼠給予等體積的蒸餾水。觀察動物的一般狀態(tài)，每2周檢測一次血糖和尿蛋白。

1.4 HE染色

每組取5只小鼠，3%戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛灌流固定，剖腹取腎臟，4%多聚甲醛固定48 h，流水沖洗3 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片機切片，厚度5 μm。60℃烤片1 h，切片脫蠟至水，蘇木素浸泡5 min，鹽酸酒精分色，流水沖洗20 min，伊紅染液染色4 min，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，光學樹膠封片，拍照。

1.5 免疫組織化學染色

切片脫蠟至水，清除內(nèi)源性過氧化物酶活性（3%H2O2浸泡10 min），高壓熱修復（修復液為檸檬酸鹽緩沖液）2 min 30 s，自然冷卻至室溫，滴加NLRP3抗體（兔抗小鼠，1：500），濕盒內(nèi)4℃過夜。室溫放置1 h，滴加生物素標記的羊抗兔IgG，室溫10 min，PBS洗滌5 min，3次。滴加辣根酶標記的鏈酶素工作液，室溫10 min，PBS洗5 min，3次。DAB顯色，雙蒸水終止。蘇木素復染5 min，鹽酸酒精分色1 s，流水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光鏡觀察拍照。

1.6 免疫印跡

每組5只小鼠，麻醉后迅速剝離腎臟，-80℃凍存。凍存的腎組織，超聲波粉碎勻漿，加入3倍體積蛋白裂解液，4℃搖床裂解30 min。提取上清（高速離心），測上清液蛋白濃度，根據(jù)濃度制備樣品。SDS-PAGE凝膠電泳，槽式濕轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)膜。TBST洗膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入配置好的NLRP3抗體（1：500），放入層析冷柜，4℃16 h。TBST洗膜3次，加入二抗（羊抗兔，1：3000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后ECL發(fā)光法顯色，以GAPDH作為內(nèi)參，采集圖像，分析光密度值，計算蛋白表達。

1.7 觀察指標

實驗過程中觀察動物的一般狀態(tài)，每2周檢測一次血糖和尿蛋白。剪鼠尾獲得血液，滴到血糖試紙上，應(yīng)用血糖儀檢測血糖。測尿蛋白前將小鼠放入代謝籠飼養(yǎng)，收集24 h尿液，應(yīng)用比色法檢測尿蛋白濃度。

1.8 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿調(diào)控糖尿病小鼠的血糖和腎功能

隨著病程的加長，糖尿病腎病組小鼠血糖值逐漸升高，8 h、12 h、16 h、20 h、24 h小檗堿治療組小鼠的血糖值明顯低于同時間的糖尿病腎病組，正常對照組小鼠血糖值無明顯改變（表1）。每2周收集一次24 h尿液，測尿蛋白數(shù)值，檢測小檗堿對糖尿病腎組織尿蛋白排出情況的影響。與對照組比較，糖尿病腎病組小鼠尿蛋白顯著升高。與糖尿病腎病組比較，小檗堿對高糖導致的尿蛋白增加有降低作用。見表2。

2.2 小檗堿減輕糖尿病小鼠腎組織病理損傷

通過HE染色觀察小檗堿對糖尿病腎組織病理變化的影響。結(jié)果顯示：正常對照組小鼠腎小體結(jié)構(gòu)完整，腎小囊腔清晰可見，無增生等病變，腎小管單層立方形上皮圍成，管腔規(guī)則。糖尿病腎病組小鼠腎小體體積增大，腎小囊腔縮小，腎小管上皮細胞染色變淺，基底膜增厚。小檗堿治療組小鼠腎小體輕度增大，腎小囊腔與對照組無明顯變化，病變范圍比糖尿病腎病組小且輕（封三圖4）。

2.3 小檗堿抑制糖尿病小鼠腎組織中NLRP3的表達

通過免疫組織化學染色和Western blot技術(shù)檢測小檗堿對糖尿病小鼠腎組織中NLRP3蛋白表達和含量的影響，結(jié)果顯示：正常對照組小鼠腎組織中NLRP3的表達較弱，糖尿病腎病組小鼠腎臟中NLRP3表達較強，小檗堿治療組小鼠腎組織中NLRP3的表達與糖尿病腎病組相比明顯減弱（封三圖5、圖1）。

3 討論

糖尿病腎?。―N）是一種由于長期高血糖引發(fā)的微血管并發(fā)癥，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，患者自身生活質(zhì)量下降，而且給家庭和社會帶來沉重的負擔。DN的發(fā)病機制至今不明，主要病理表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜基質(zhì)合成增加，降解減少，系膜區(qū)變寬或結(jié)節(jié)形成，基底膜增厚，隨著病程的進展，逐步發(fā)展為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[6，7]。2002年，Tschopp首先提出了炎癥小體的概念，隨后，人們相繼發(fā)現(xiàn)了NLRP1、AIM2、NLRP3、NLRC4等炎癥小體[8，9]。在這些炎癥小體中，對NLRP3的研究最為廣泛。NLRP3在靜息狀態(tài)下無活性，當細胞受到某種刺激后，NLRP3與凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）結(jié)合，招募pro-caspase-1形成復合體，使其成為有生物活性的caspase-1，即白細胞介素-1β （interleukin，IL-1β）轉(zhuǎn)化酶，后者作用于炎癥因子前體如pro-IL-18等，產(chǎn)生具有致炎活性的IL-18，參與機體天然免疫應(yīng)答及細胞損傷[10]。研究報道，炎癥小體NLRP3參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，如糖尿病腎病、腎臟纖維化、足細胞損傷等[11]。靶向NLRP3通路對糖尿病和糖尿病腎病的治療具有一定的作用。

小檗堿是中藥黃連的有效成分，除了具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，還可降低血糖和血脂。學者們對小檗堿治療糖尿病的機制進行大量的研究，文獻報道小檗堿能夠增強脂肪細胞和骨骼肌對糖的攝取和消耗，增加肝臟和肌組織胰島素受體的表達[12，13]。小檗堿還具有增加肝臟低密度脂蛋白的作用，從而降低血清中的膽固醇和血糖。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以阻止T淋巴細胞的分化和巨噬細胞的游走，從而減輕促炎癥因子的釋放。在糖尿病腎病的治療中，小檗堿也有顯著的療效，能夠減輕糖尿病腎病的病理進程，保護腎小球足細胞免受損傷，維持濾過屏障的完整[14]。

文獻報道，炎癥反應(yīng)與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，長期的高血糖會導致NLRP3炎癥小體的活化，活化的NLRP3激活caspase-1等凋亡蛋白，誘導腎小管上皮細胞或足細胞凋亡[15，16]。小檗堿具有降糖降脂的作用，廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療，小檗堿是否與糖尿病腎組織中炎癥小體的活化有關(guān)，報道較少。為此，本研究從炎癥小體角度探索小檗堿的作用機制。推測小檗堿通過抑制NLRP3炎癥小體的活化，降低炎癥反應(yīng)，減輕細胞凋亡損傷，從而改善糖尿病腎病癥狀。為了驗證這一假說，本課題組選擇C57小鼠為實驗動物，先以高脂高糖飲食喂養(yǎng)，再小劑量注射STZ破壞胰島細胞，制備了2型糖尿病腎病模型。小檗堿采用灌胃的方式給藥。實驗發(fā)現(xiàn)小檗堿不僅降低血糖，而且降低尿蛋白，明顯改善腎功能。HE染色是觀察腎組織形態(tài)變化的經(jīng)典方法，染色結(jié)果顯示，長期高糖，小鼠腎小體腫大，腎小管上皮細胞空泡變性，小檗堿能夠減輕這些病理損傷。免疫組化和免疫印跡結(jié)果證實高糖誘導NLRP3的表達，而小檗堿顯著抑制NLRP3表達。

綜上，本研究證實了小檗堿具有降低血糖、減少尿蛋白，改善糖尿病腎病癥狀的作用。小檗堿通過抑制NLRP3炎癥小體的活化改善糖尿病腎功能。在后續(xù)的實驗中，還將對NLRP3下游蛋白和細胞因子的變化進行深入研究，進一步揭示小檗堿的作用機制。

[參考文獻]

[1] Umanath K，Lewis JB. Update on diabetic nephropathy：Core curriculum 2018[J]. Am J Kidney Dis，2018，71（6）：884-895.

[2] Bao L，Li J，Zha D，et al. Chlorogenic acid prevents diabetic nephropathy by inhibiting oxidative stress and inflammation through modulation of the Nrf2/HO-1 and NF-κB pathways[J]. Int Immunopharmacol，2018，54：245-253.

[3] Luan P，Zhuang J，Zou J，et al. NLRC5 deficiency ameliorates diabetic nephropathy through alleviating inflammation[J]. FASEB J，2018，32（2）：1070-1084.

[4] Giuliani KTK，Kassianos AJ，Healy H，et al. Pigment nephropathy：Novel insights into inflammasome-mediated pathogenesis[J]. Int J Mol Sci，2019，20（8）：1997.

[5] Malte K？觟lling，Tamas Kaucsar，Celina Schauerte，et al. Therapeutic miR-21 silencing ameliorates diabetic kidney disease in mice[J]. Mol Ther，2017，25（1）：165-180.

[6] Nagib AM，Elsayed Matter Y，Gheith OA，et al. Diabetic nephropathy following posttransplant diabetes mellitus[J]. Exp Clin Transplant，2019，17（2）：138-146.

[7] Bhadauria D，Chellappan A，Kaul A，et al. Idiopathic membranousnephropathyin patients with diabetes mellitus：A diagnostic and therapeutic quandary[J]. Clin Kidney J，2018，11（1）：46-50.

[8] Guo Q，Wu Y，Hou Y，et al. Cytokine secretion and pyroptosis of thyroid follicular cells mediated by enhanced NLRP3，NLRP1，NLRC4，and AIM2 inflammasomes are associated with autoimmune thyroiditis[J]. Front Immunol，2018，9：1197.

[9] Liang F，Zhang F，Zhang L，et al. The advances in pyroptosis initiated by inflammasome in inflammatory and immune diseases[J]. Inflamm Res，2020，69（2）：159-166.

[10] Sano S，Oshima K，Wang Y，et al.Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome[J]. J Am Coll Cardiol， 2018，71（8）：875-886.

[11] Shi Y，Huang C，Zhao Y，et al. RIPK3 blockade attenuates tubulointerstitial fibrosis in a mouse model of diabetic nephropathy[J]. Sci Rep，2020，10（1）：10458.

[12] Li Y，Wang B，Shen J，et al. Berberine attenuates fructose-induced insulin resistance by stimulating the hepatic LKB1/AMPK/PGC1α pathway in mice[J]. Pharm Biol，2020，58（1）： 385-392.

[13] El-Zeftawy M，Ghareeb D，ElBealy ER，et al. Berberine chloride ameliorated PI3K/Akt-p/SIRT-1/PTEN signaling pathway in insulin resistance syndrome induced in rats[J]. J Food Biochem，2019，43（12）：e13049.

[14] Qin X，Jiang M，Zhao Y，et al. Berberine protects against diabetic kidney disease via promoting PGC-1α-regulated mitochondrial energy homeostasis[J]. Br J Pharmacol，2019， online.

[15] An X，Zhang Y，Cao Y，et al. Punicalagin protects diabetic nephropathy by inhibiting pyroptosis based on TXNIP/NLRP3 pathway[J]. Nutrients，2020，12（5）：1516.

[16] Ding S，Xu S，Ma Y，et al. Modulatory mechanisms of the NLRP3 inflammasomes in diabetes[J]. Biomolecules，2019， 9（12）：850.

（收稿日期：2020-04-23）

[基金項目] 遼寧省自然科學基金項目（20170540341、20170540393、20180550649）;遼寧省教育廳青年科技人才“育苗”項目（JYTQN201917）

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