楊曉新， 王澤華， 蔡 娥△

1武漢大學附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)婦產(chǎn)科，武漢 430060 2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022

宮頸癌是全球女性第4常見的惡性腫瘤，2018年新發(fā)病例約57萬例，死亡人數(shù)高達31.1萬例，并且80%發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。盡管宮頸癌篩查及HPV疫苗的普及一定程度上降低了宮頸癌的發(fā)病率，但仍有一部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于宮頸癌的中晚期，治療效果及預后較差。宮頸癌局部浸潤是導致患者臨床分期靠后的主要原因，因此探究宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制十分必要。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞失去細胞極性和細胞間粘附能力，獲得遷移及侵襲等間質(zhì)細胞特性的過程，該過程伴隨著上皮細胞表型如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達下降以及間質(zhì)細胞表型如波形蛋白(Vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)等分子的表達上升。已有證據(jù)表明宮頸癌細胞發(fā)生EMT與浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]，然而調(diào)控宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移及EMT的關(guān)鍵分子仍待進一步研究。整合素是一類異二聚體跨膜粘附分子，由18種α亞基和8種β亞基可以組合出24種亞型，在人體內(nèi)表達于多種細胞表面，可以介導細胞與細胞、細胞與基質(zhì)的相互作用[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)整合素α5參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。例如，在乳腺癌、結(jié)直腸癌及卵巢癌等腫瘤細胞中，整合素α5均高表達，并且與患者的不良預后相關(guān)，體外實驗進一步證實其能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及耐藥等多種惡性生物學行為[5-7]。Wang等[8]的研究顯示宮頸癌組織中整合素α5β1表達水平明顯高于正常宮頸組織，然而整合素α5的具體作用尚不清楚。因此，本研究旨在進一步探究整合素α5對宮頸癌的預后意義以及對宮頸癌細胞SiHa遷移、侵襲及EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人宮頸癌細胞系SiHa購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)液、四季青胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素溶液及LB培養(yǎng)液均購自上海源培有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；人整合素α5質(zhì)粒、NC質(zhì)粒及菌液均購自上海吉瑪有限公司。高純度質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司。Transwell小室和基質(zhì)膠購自美國Corning公司；整合素α5、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、GAPDH一抗均購自英國Abcam公司，二抗及DAPI均購自美國KPL公司。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。NP40裂解液、Cocktail、ECL超敏檢測試劑、SDS-PAGE配制試劑盒、蛋白上樣緩沖液、電泳液及轉(zhuǎn)膜液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析整合素α5對宮頸癌患者預后的影響 利用在線工具Kaplan-Meier Plotter(KM-plotter，https：//kmplot.com/analysis/[9])分析整合素α5 mRNA表達水平與宮頸癌患者總生存期(overall survival，OS)的相關(guān)性。篩選的條件設(shè)定為：①mRNA RNA-seq：Start KM plotter for pan-cancer；②Gene symbol：ITGA5，RNA-Seq ID；③Split patients by：Auto select best cutoff；④Survival：OS；⑤Follow up threshold：all；⑥Select all：Cervical squamous cell carcinoma(n=304)；其余選擇默認設(shè)置。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將SiHa細胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素)，放置37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%左右即可傳代處理。

1.2.3 質(zhì)粒提取 取10 μL菌液加入含20 mL LB培養(yǎng)液的無菌離心管中，加入20 μL 100 mg/mL氨芐青霉素溶液(所購整合素α5和NC質(zhì)粒均含氨芐青霉素抗性基因)，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。按質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行操作。利用NanoDrop 2000測量質(zhì)粒溶液濃度，直接進行轉(zhuǎn)染操作或-20℃保存。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 SiHa細胞轉(zhuǎn)染分為2組：plasmid NC組，plasmid α5組，分別轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒和過表達整合素α5質(zhì)粒。取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化成單個細胞，進行細胞計數(shù)，取2×105個細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁并生長至70%左右密度進行轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染操作參照Lipofectamine 2000說明書。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞用于檢測轉(zhuǎn)染效率及進行后續(xù)實驗。

1.2.5 Transwell遷移侵襲實驗 侵襲實驗：在冰上按無血清RPMI培養(yǎng)液∶基質(zhì)膠=30∶1的比例配制所需基質(zhì)膠，吸取100 μL輕柔加入Transwell小室上層，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h后取出小室，吸棄上室多余液體，加入2×105的SiHa細胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液。細胞37℃培養(yǎng)箱孵育36 h。取出小室，棉簽擦去上室表面細胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色2 h，PBS沖洗3次，顯微鏡下拍照并計數(shù)。遷移實驗：不需要加入基質(zhì)膠稀釋液，其余步驟同侵襲實驗。

1.2.6 Western blot實驗 收集轉(zhuǎn)染后的細胞，加入含1% Cocktail的NP40裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入稀釋后的整合素α5(1∶2000)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶200)、Vimentin(1∶400)、GAPDH(1∶5000)一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入二抗(1∶5000)，室溫孵育1.5 h，TBST漂洗3次，采用ECL法發(fā)光顯影。

1.2.7 qRT-PCR檢測 收集轉(zhuǎn)染后的細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，NanoDrop 2000測定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA。Amplification機器進行DNA擴增，條件如下：酶活化95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火及延伸60℃ 30 s。反應完成后得到各孔Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA表達水平。

1.2.8 免疫熒光檢測 將轉(zhuǎn)染后的細胞用胰酶消化成單個細胞，細胞計數(shù)儀計數(shù)，取1.5×104的細胞接種于24孔板，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，每孔加入4%多聚甲醛300 μL，室溫固定30 min，PBS漂洗2次，加入0.5%Triton X-100破膜液300 μL，室溫靜置10 min，吸棄破膜液，加入0.5%BSA封閉液300 μL處理1 h。吸棄封閉液，分別加入一抗E-cadherin(1∶200)，Vimentin(1∶400)，N-cadherin(1∶200)，4℃孵育過夜。次日棄一抗，加入PBS放置搖床上漂洗3次，每次5 min。然后E-cadherin組加入綠色熒光二抗(1∶200)，Vimentin、N-cadherin組加入紅色熒光二抗(1∶200)，室溫孵育1 h，隨后PBS搖床上避光漂洗3次，每次5 min。隨后每孔加入核染色劑DAPI(1∶5000)，孵育5 min，PBS漂洗3次。隨后熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 整合素α5表達與宮頸癌患者預后的關(guān)系

KM-plotter生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中整合素α5 mRNA表達水平與患者總生存期(OS)呈負相關(guān)，即整合素α5表達越高，患者總生存時間越短(HR=2.86，95%CI=1.79～4.57，P<0.01)。見圖1。

圖1 宮頸癌中整合素α5表達與患者預后的相關(guān)性Fig.1 Correlation between the expression of integrin α5 and prognosis of patients with cervical cancer

2.2 整合素α5質(zhì)粒成功上調(diào)SiHa細胞中α5表達水平

為了檢測整合素α5過表達質(zhì)粒的調(diào)控效率，我們采用qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相較于NC質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染了α5過表達質(zhì)粒的SiHa細胞其整合素α5在mRNA水平上調(diào)了17330.3倍，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義(圖2A)。Western blot顯示轉(zhuǎn)染α5質(zhì)粒組較NC組整合素α5蛋白表達明顯增多(圖2B)。

圖2 qRT-PCR(A)和Western blot(B)驗證SiHa細胞中整合素α5上調(diào)Fig.2 Detection of the upregulation of integrin α5 expression in SiHa cells by qRT-PCR(A)and Western blot(B)

2.3 上調(diào)整合素α5增強宮頸癌SiHa細胞遷移和侵襲能力

為了確定整合素α5對宮頸癌SiHa細胞遷移和侵襲的影響，我們采用Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力變化。遷移實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒的對照組中，穿膜細胞個數(shù)為(36.0±5.0)，α5質(zhì)粒上調(diào)組穿膜細胞個數(shù)為(69.3±5.7)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；侵襲實驗結(jié)果顯示，NC組穿膜細胞個數(shù)為(22.3±2.1)，α5質(zhì)粒上調(diào)組穿膜細胞個數(shù)為(38.7±2.1)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明上調(diào)SiHa細胞中整合素α5可以增強細胞遷移和侵襲能力(圖3)。

2.4 上調(diào)整合素α5促進宮頸癌細胞SiHa發(fā)生EMT

為了進一步探究整合素α5對宮頸癌細胞SiHa上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的影響，我們采用Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測整合素α5上調(diào)組及NC組中EMT相關(guān)分子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的表達變化。結(jié)果顯示(圖4)：在SiHa細胞中上調(diào)整合素α5后，E-cadherin表達下降，熒光強度減弱，而Vimentin、N-cadherin表達增加，熒光強度增強，說明整合素α5促進SiHa細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖3 整合素α5對宮頸癌細胞SiHa遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of integrin α5 on migration and invasion of cervical cancer cells SiHa

A：Western blot檢測E-cadherin、Vimentin及N-cadherin蛋白表達水平變化；B：免疫熒光檢測E-cadherin、Vimentin及N-cadherin蛋白表達水平變化，標尺=50μm。圖4 整合素α5對EMT相關(guān)分子的影響Fig.4 Effect of integrin α5 on EMT-related proteins

3 討論

宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者5年生存率明顯下降。腫瘤細胞遷移、侵襲能力增強是導致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[10]，本研究利用在線數(shù)據(jù)庫KM-plotter進行預后分析，結(jié)果顯示宮頸癌患者整合素α5高表達與不良預后相關(guān)，并且首次探究了整合素α5對宮頸癌細胞SiHa遷移侵襲的作用，發(fā)現(xiàn)整合素α5可以促進SiHa細胞的遷移侵襲能力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。

整合素α5作為細胞粘附分子中的一員，在多種腫瘤中發(fā)揮促癌基因的功能。在乳腺癌中，整合素α5通過ITGA5/Src/Vav2/Rac1通路促進腫瘤細胞生長及轉(zhuǎn)移[5]；在結(jié)腸癌中，下調(diào)整合素α5可減緩腫瘤生長，促進腫瘤凋亡[6]。在本研究中，我們首先通過數(shù)據(jù)庫大樣本分析304例宮頸癌患者組織中整合素α5表達水平與預后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)整合素α5高表達的患者總生存時間明顯短于低表達患者，這與之前Wang等[8]研究報道相一致。隨后，通過體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)宮頸癌細胞SiHa中整合素α5的表達，并采用Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲能力，發(fā)現(xiàn)SiHa細胞整合素α5表達增加后，細胞遷移、侵襲明顯增強。這一結(jié)果提示整合素α5在宮頸癌的進展尤其是轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要促進作用。

EMT被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始步驟，它使腫瘤細胞運動及侵襲能力增強，從而促進腫瘤脫離原發(fā)病灶，向遠處播散[11]。有研究提示在乳腺癌中，整合素α5可以通過使Rac1b定位于細胞膜從而促進腫瘤細胞發(fā)生EMT[12]。通過Western blot及細胞免疫熒光技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在SiHa細胞中上調(diào)整合素α5表達可以使E-cadherin表達下降，Vimentin、N-cadherin表達上升，提示整合素α5促進SiHa細胞的EMT過程。這與上述整合素α5促進SiHa細胞遷移、侵襲能力的結(jié)果相符合。提示整合素α5可能通過影響腫瘤細胞EMT過程從而影響細胞遷移、侵襲能力，具體機制仍待進一步研究。

綜上所述，本研究首次通過生物信息學方法分析了臨床大樣本數(shù)據(jù)庫資料，發(fā)現(xiàn)了整合素α5在宮頸癌中的預后意義，提示其作為宮頸癌預后生物標記物的潛在意義。并且在體外水平揭示了整合素α5對宮頸癌細胞SiHa遷移、侵襲能力及EMT的促進作用，為研究整合素α5在宮頸癌轉(zhuǎn)移中作用提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為晚期宮頸癌的治療提供了新思路。