王曉平， 黃 斌， 馬 帥， 黃 睿， 李曉佳

四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，成都 610072

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，以漸進(jìn)性的認(rèn)知功能障礙及行為損害為典型的臨床特征[1-2]。目前對(duì)阿爾茨海默病尚無(wú)特效治療藥物。臨床有采用免疫抑制劑治療阿爾茨海默病的報(bào)道，且取得一定療效。免疫抑制劑中較為典型的是嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil)，但免疫抑制劑治療阿爾茨海默病的機(jī)理仍不明確[3]。報(bào)道顯示自噬活性降低是阿爾茨海默病的特點(diǎn)之一，自噬通路相關(guān)蛋白中研究較為明確的是微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)與Beclin-1蛋白，2種蛋白在阿爾茨海默病患者腦內(nèi)呈低表達(dá)[4-5]，嗎替麥考酚酯治療阿爾茨海默病對(duì)自噬是否存在影響，較少報(bào)道。本研究制備阿爾茨海默病大鼠模型，觀察免疫抑制劑治療對(duì)阿爾茨海默病的療效及對(duì)2種自噬蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±30)g，購(gòu)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004。溫度(25±5)℃，相對(duì)濕度(40±10)%下，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 受試藥、儀器和試劑

嗎替麥考酚酯膠囊(無(wú)錫福祈制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20080642，規(guī)格：0.25 g/片，以C23H31NO7計(jì))；多奈哌齊片[衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20050978，規(guī)格：5 mg/片]；DW-5型大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；FluoView FV1200激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；兔抗鼠LC3、Beclin-1和β-actin(美國(guó)Abcam公司)；Aβ25-35(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 制備阿爾茨海默病大鼠模型、分組及給藥

采用戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，將頭部固定在立體定位儀上，剪開(kāi)頭部皮膚，暴露顱骨，定位前囟，于前囟后1.5 mm及旁開(kāi)0.8 mm定位側(cè)腦室，顱骨鉆鉆孔，骨窗直徑約2 mm，將2 μL凝聚態(tài)Aβ25-35以微量注射器緩慢進(jìn)針，深度4 mm，回退1 mm，緩慢注射5 min，留針5 min，退針并縫合皮膚，碘伏消毒皮膚。對(duì)照組在側(cè)腦室注射生理鹽水2 μL，注射方式同前。存活大鼠用于實(shí)驗(yàn)。將制備的阿爾茨海默病大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、嗎替麥考酚酯高劑量組、嗎替麥考酚酯低劑量組和陽(yáng)性藥組，每組10只。除對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，嗎替麥考酚酯高劑量組(0.8 g/kg)、嗎替麥考酚酯低劑量組(0.4 g/kg)和陽(yáng)性藥組(多奈哌齊0.5 mg/kg)在大鼠清醒后給藥，所有大鼠均連續(xù)灌胃給藥4周。

1.4 識(shí)別實(shí)驗(yàn)

不透明檢測(cè)箱，規(guī)格80 cm×60 cm×60 cm，將大鼠進(jìn)行3個(gè)階段的訓(xùn)練：適應(yīng)階段、訓(xùn)練階段與檢測(cè)階段。適應(yīng)階段：將大鼠置于無(wú)任何物體的檢測(cè)箱內(nèi)，自由活動(dòng)5 min，放回籠中；24 h后進(jìn)入訓(xùn)練階段：在檢測(cè)箱內(nèi)放置2個(gè)相同的物體，將大鼠背對(duì)2物體置于檢測(cè)箱內(nèi)，大鼠熟悉2個(gè)物體，10 min后，取出大鼠；24 h后進(jìn)入檢測(cè)階段：將檢測(cè)箱內(nèi)的2物體中的1個(gè)換為不同形狀的新物體，將大鼠再次放入檢測(cè)箱內(nèi)5 min，記錄大鼠用鼻子湊近新物體≤ 1 cm的范圍或舔咬或用身體擦蹭新物體的時(shí)間，即為大鼠對(duì)新物體和舊物體的探索時(shí)間。以識(shí)別指數(shù)(discrimination index，DI)來(lái)評(píng)價(jià)大鼠對(duì)2個(gè)不同測(cè)試物體的探索時(shí)間，計(jì)算公式：DI=(N-F)/(N + F)×100%，N：大鼠探索新物體所耗費(fèi)的時(shí)間，F(xiàn)：大鼠探索熟悉物體所耗費(fèi)的時(shí)間。每次每只大鼠放入檢測(cè)箱后，都用75%乙醇溶液擦拭檢測(cè)箱和2個(gè)物體。

1.5 水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮桶內(nèi)注入溫度(24±2)℃的清水，水面高于平臺(tái)2 cm，滴加藍(lán)黑墨水，排除視覺(jué)干擾。于水桶上緣，等距離劃分4個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁從其中一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠游到平臺(tái)并站在平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期，若尋找平臺(tái)時(shí)間超過(guò)120 s，記錄逃避潛伏期記為120 s，放回籠中。每天每只大鼠記錄逃避潛伏期1次，連續(xù)5 d，記錄5 d的逃避潛伏期及5 d的游泳距離，取均值。第6天撤去平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠置于水中，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)，用以檢測(cè)大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶。

1.6 Tunel染色

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠斷頭取腦，冰上分離海馬組織并提取蛋白，剩余的腦組織采用水合氯醛固定，經(jīng)30%蔗糖沉降48 h后，用振動(dòng)切片機(jī)制備30 μm小腦組織切片，用于Tunel染色，光鏡下觀察小腦細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測(cè)

取“1.6 Tunel染色”項(xiàng)下從海馬組織提取的蛋白行Western blot檢測(cè)，制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵LC3和Beclin-1一抗，工作濃度均為1∶1000，內(nèi)參為β-actin(工作濃度為1∶200)，過(guò)夜、二抗室溫1 h，將膜置于凝膠成像儀中，加入ECL發(fā)光劑，曝光顯影，采用Image J軟件分析LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，識(shí)別實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及水迷宮指標(biāo)等計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的識(shí)別指數(shù)、潛伏期、游泳距離及穿環(huán)次數(shù)比較

與對(duì)照組比較，模型組的識(shí)別指數(shù)和穿環(huán)次數(shù)明顯降低(均P<0.05)，潛伏期和游泳距離明顯增高(均P<0.05)；與模型組比較，嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性藥組的識(shí)別指數(shù)和穿環(huán)次數(shù)明顯增高(均P<0.05)，潛伏期和游泳距離明顯降低(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠的識(shí)別指數(shù)、潛伏期、游泳距離及穿環(huán)次數(shù)比較Table 1 Comparison of recognition index，latency，swimming distance and frequency of piercing cycles of rats in each

2.2 各組大鼠的小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

鏡下顯示，凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞呈棕色。與對(duì)照組比較，模型組凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞明顯增多；與模型組比較，嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性藥組凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞有明顯減少；免疫抑制組中，凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞呈劑量依賴性降低趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：?jiǎn)崽纣溈挤吁サ蛣┝拷M；D：?jiǎn)崽纣溈挤吁ジ邉┝拷M；E：陽(yáng)性藥組圖1 各組大鼠小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡TUNEL染色(×200)Fig.1 Detection of cerebellar nerve cell apoptosis by Tunel staining in rats of each group(×200)

2.3 各組大鼠海馬的自噬蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬的Beclin-1和LC3表達(dá)明顯降低(均P<0.05)；與模型組比較，嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性藥組Beclin-1和LC3表達(dá)明顯增高(均P<0.05)，且嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組存在劑量依賴性趨勢(shì)，見(jiàn)表2和圖2。

表2 各組大鼠海馬的自噬蛋白表達(dá)Table 2 Expression of autophagy protein in hippocampus of rats in each

1：對(duì)照組；2：模型組；3：?jiǎn)崽纣溈挤吁サ蛣┝拷M；4：?jiǎn)崽纣溈挤吁ジ邉┝拷M；5：陽(yáng)性藥組圖2 各組大鼠海馬Beclin-1和LC3表達(dá)Fig.2 Expression of Beclin-1 and LC3 in hippocampus of rats in each group

3 討論

本研究通過(guò)側(cè)腦室注射Aβ25-35制作阿爾茨海默病大鼠模型，分別采用識(shí)別實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示與進(jìn)行假手術(shù)的對(duì)照組大鼠比，阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低，表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙，表明阿爾茨海默病大鼠模型可用于研究。

自噬是一種存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞代謝現(xiàn)象，通過(guò)降解錯(cuò)誤折疊及老化的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)代謝環(huán)境穩(wěn)定。但自噬過(guò)度或自噬損傷等自噬異常時(shí)反而對(duì)細(xì)胞功能帶來(lái)不利影響。大量研究顯示，自噬異常間接地為有害物質(zhì)損傷神經(jīng)提供了保護(hù)，因此自噬異常參與了很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如阿爾茨海默病、帕金森癥及亨廷頓病。阿爾茨海默病重要的神經(jīng)病理特點(diǎn)之一是大腦存在顯著Aβ蛋白沉積，且Aβ蛋白積聚程度與阿爾茨海默病的嚴(yán)重程度緊密關(guān)聯(lián)[6-8]。研究顯示阿爾茨海默病患者及阿爾茨海默病動(dòng)物模型腦組織中可編碼Beclin-1蛋白的Beclin-1基因含量降低，Beclin-1基因轉(zhuǎn)錄減少及其蛋白表達(dá)缺失，致使自噬水平及活性降低，自噬體形成減少，Aβ蛋白生成而不被降解，形成異常沉積，最終導(dǎo)致阿爾茨海默病。可見(jiàn)Beclin-1減少與自噬缺陷及阿爾茨海默病發(fā)病緊密關(guān)聯(lián)[9-11]。LC3是定位于自噬泡內(nèi)膜的自噬調(diào)節(jié)蛋白，細(xì)胞啟動(dòng)自噬，LC3前體被加工為L(zhǎng)C3-Ⅰ并溶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，LC3-Ⅰ與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合生成LC3-Ⅱ，并定位于自噬泡膜，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，故LC3蛋白表達(dá)可直接反映細(xì)胞自噬活性[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，阿爾茨海默病模型大鼠海馬的Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)明顯降低，提示阿爾茨海默病大鼠海馬組織的自噬功能或活性降低，與報(bào)道結(jié)果類似。

嗎替麥考酚酯屬于免疫抑制劑，藥代動(dòng)力學(xué)顯示，嗎替麥考酚酯屬于前體藥物，進(jìn)入人體后水解為霉酚酸而發(fā)揮免疫抑制的功效。有研究報(bào)道采用嗎替麥考酚酯可有效地控制阿爾茨海默病病情的進(jìn)一步發(fā)展[14]。本研究結(jié)果顯示，給予阿爾茨海默病大鼠嗎替麥考酚酯連續(xù)4周，大鼠的識(shí)別實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)均獲得較好的結(jié)果，且存在嗎替麥考酚酯劑量依賴性關(guān)系，提示嗎替麥考酚酯具有改善阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知障礙的效果。

通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)嗎替麥考酚酯對(duì)大鼠小腦凋亡細(xì)胞及海馬自噬蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，與阿爾茨海默病模型大鼠比較，嗎替麥考酚酯可緩解大鼠小腦細(xì)胞凋亡，增高阿爾茨海默病大鼠海馬Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)，提示嗎替麥考酚酯有助于提高阿爾茨海默病大鼠在海馬區(qū)的自噬活性。報(bào)道顯示，Aβ蛋白積聚可促使炎癥反應(yīng)，腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞可被激活，參與體內(nèi)某種免疫應(yīng)答反應(yīng)，分泌大量的炎性因子，如白介素-6(interleukin-6，IL-6)和干擾素(interferon-γ，IFN-γ)，進(jìn)而介導(dǎo)神經(jīng)炎性反應(yīng)[15-16]，導(dǎo)致阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展。嗎替麥考酚酯可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性[17]，小膠質(zhì)細(xì)胞活性與Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到嗎替麥考酚酯對(duì)Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)的干預(yù)效果可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。但嗎替麥考酚酯對(duì)Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)的干預(yù)機(jī)制仍需更多的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，嗎替麥考酚酯可以改善阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力，其機(jī)制可能與增強(qiáng)自噬水平和提高自噬蛋白Beclin-1和LC3表達(dá)相關(guān)，具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。