魏鈺娟 潘曉藝 藺凌云 赟姚嘉 郝貴杰 曹 錚 夏焱春 尹文林 劉憶瀚 沈錦玉，

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201200； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 湖州 313001)

鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ， CyHV-2)又被稱為皰疹病毒性造血器官壞死病病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis virus， HVHNV)(徐進(jìn)等， 2013)或金魚造血器官壞死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus， GFHNV)(Jefferyet al， 2007)與鯉科魚類的其他兩種皰疹病毒CyHV-1(Carp pox)和CyHV-3(Koi herpesvirus， KHV)同屬于異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)。CyHV-2 于1992—1993 年間給日本西部養(yǎng)殖的金魚造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 患病金魚死亡率高達(dá)100% (Junget al， 1995)。隨后其他國(guó)家和地區(qū)也相繼有了該 病暴發(fā)的報(bào)道， 1997 年春季在美國(guó)西海岸一循環(huán)水養(yǎng)殖場(chǎng)的金魚幼魚出現(xiàn)大量死亡， 死亡率高達(dá)80%以上， 后經(jīng)證實(shí)其發(fā)病是由CyHV-2 感染引起的。觀賞魚的國(guó)際貿(mào)易很大程度上促進(jìn)了該病的跨區(qū)域傳播， 隨后中國(guó)臺(tái)灣、澳大利亞、英國(guó)養(yǎng)殖的金魚相繼暴發(fā)該病(Stephenset al， 2004； Jefferyet al， 2007； Hansonet al， 2011)。2011 年匈牙利報(bào)道了養(yǎng)殖的銀鯽也發(fā)現(xiàn)了CyHV-2 感染。而中國(guó)大面積暴發(fā)該病始于2009年， 主要發(fā)生在江蘇省鯽魚養(yǎng)殖區(qū)射陽(yáng)、大豐、寶應(yīng)、高郵、東臺(tái)等地， 發(fā)病總面積在6600ha 以上， 發(fā)病嚴(yán)重的塘口死亡率高達(dá)90%， 造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元(桂建芳， 2009； Xuet al， 2013)。與此同時(shí)， 在湖北、湖南、江西、浙江等省份， 也相繼在患病鯽魚體內(nèi)檢測(cè)出CyHV-2。

細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)是病毒病診斷的經(jīng)典方法， 也常被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)所推薦。CyHV-2 敏感細(xì)胞系的建立對(duì)CyHV-2 的分離、特征分析和細(xì)胞滅活疫苗研究都具有重要作用。但已有研究發(fā)現(xiàn)CyHV-2 很難在魚類病毒分離常用的細(xì)胞系中進(jìn)行連續(xù)的傳代(馬杰等， 2016)， 比如胖頭鯉細(xì)胞(fathead minnow cells， FHM) (Junget al， 1995)、鯉魚上皮瘤細(xì)胞(epithelioma papulosum cyprini， EPC)、草魚卵巢細(xì)胞(grass carp ovary， CO)、草 魚 腎 細(xì) 胞(grass carp kidney， CIK)均對(duì)CyHV-2 不敏感， 僅錦鯉鰭細(xì)胞(koi fin， KF-1)能產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)， 但病毒在KF-1細(xì)胞上傳至第3—5 代后， CPE消失且檢測(cè)不到病毒核酸(Junget al， 1995)。雖然已有學(xué)者建立了異育銀鯽腦組織細(xì)胞系(Maet al， 2015)和鰭條細(xì)胞系(Luet al， 2018)， 且對(duì)CyHV-2 敏感， 但由于不對(duì)外供應(yīng)， 還是缺乏CyHV-2 敏感的細(xì)胞系， 限制了對(duì)CyHV-2 的研究， 因此建立對(duì)CyHV-2 敏感的細(xì)胞系并研究該細(xì)胞系的生物學(xué)特性， 對(duì)CyHV-2 進(jìn)行連續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)從而深入研究病毒的特性， 具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患鯽造血器官壞死病異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)采集自江蘇鹽城某鯽魚養(yǎng)殖場(chǎng)。健康異育銀鯽來自于浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗(yàn)基地， 平均體重120±20g/尾， 實(shí)驗(yàn)前于室內(nèi)養(yǎng)殖水池暫養(yǎng)。L-15細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、磷酸緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA、秋水仙素均購(gòu)自Sigma 公司， 胎牛血清購(gòu)自GIBICO 公司， DNA 核酸提取試劑為天根產(chǎn)品； PCR 用rTaq 預(yù)混液購(gòu)為TaKaRa 公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管、細(xì)胞凍存管均購(gòu)自Corning 公司。

1.2 鯽魚脊髓細(xì)胞系的建立

1.2.1 原代培養(yǎng) 健康異育銀鯽以75%酒精進(jìn)行體表消毒3—4 次， 無(wú)菌條件下取出異育銀鯽脊髓組織， 置于含200U/mL 青霉素和200μg/mL 鏈霉素的Hank’s 平衡鹽溶液(HBSS)中(圖1)， 清洗三次。然后將洗干凈的組織移至盛有L-15 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中進(jìn)行平衡。根據(jù)Freshney(2010)和薛慶善(2001)原代培養(yǎng)法， 采用組織塊移植法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。將上述的脊髓組織剪成約 0.1mm3的組織塊， 然后移植到25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底面， 倒置平放， 24°C 恒溫培養(yǎng)， 放組織塊的一面朝上， 培養(yǎng)瓶中添加3mL 含20%V/V胎牛血清、100U/mL 青霉素、100μg/mL 鏈霉素的L-15 培養(yǎng)液， 過夜， 慢慢將培養(yǎng)瓶正置過來進(jìn)行培養(yǎng)， 每2—3 天更換培養(yǎng)液一次， 倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

圖1 培養(yǎng)皿中異育銀鯽脊髓組織 Fig.1 Spinal cord tissue of C. auratus gibelio in culture dish

1.2.2 傳代培養(yǎng) 參照肖藝等(2012)的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞從組織塊中遷出單層達(dá)培養(yǎng)瓶底面積90%時(shí)， 采用胰蛋白酶消化法按1 瓶傳2 瓶的方式進(jìn)行傳代， 24°C 培養(yǎng)， 待細(xì)胞再次形成單層后， 再同法進(jìn)行傳代培養(yǎng)， 直至獲得穩(wěn)定傳代的異育銀鯽脊髓組織細(xì)胞系CSC。并對(duì)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系添加細(xì)胞凍存液后進(jìn)行液氮保存。

1.2.3 細(xì)胞染色體核型分析 對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CSC 細(xì)胞， 加入終濃度為0.4μg/mL 的秋水仙素， 25°C 孵育4h 后胰酶消化收集細(xì)胞， 用0.075mol/L 的KCl 溶液低滲處理25min 后加入預(yù)冷的卡諾固定液， 1000r/min離心5min去上清后再用預(yù)冷的卡諾固定液固定3 次， 每次15min。冷滴片法滴片， 干燥后用5% Giemsa 染色25min， 流水沖洗， 干燥后顯微鏡觀察。100倍油鏡下隨機(jī)選取100 個(gè)細(xì)胞， 統(tǒng)計(jì)其染色體數(shù)目。

1.3 CSC 細(xì)胞對(duì)CyHV-2 的敏感性

1.3.1 對(duì)CyHV-2 的敏感性 將鯉皰疹病毒Ⅱ型陽(yáng)性的病魚腎臟、脾臟、腦、脊髓組織剪碎， 并加等體積PBS 進(jìn)行勻漿， 勻漿液5000r/min 4°C 離心15min 后， 上清經(jīng)0.45μm 和0.22μm 濾膜過濾， 制備成無(wú)菌組織勻漿濾液。將病毒濾液按1︰10 和1︰20的稀釋度感染培養(yǎng)至單層的CSC 細(xì)胞， 24°C 吸附1h后， 棄去病毒稀釋液， 換成血清濃度為2%的L-15 維持液繼續(xù)24°C 培養(yǎng)， 逐日觀察細(xì)胞病變情況(Wanget al， 2016)。

1.3.2 病毒的TCID50測(cè)定 在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將CSC 細(xì)胞培養(yǎng)至單層細(xì)胞， 用維持液將CyHV-2 感染CSC 細(xì)胞7d 后的病毒裂解液作連續(xù)10 倍稀釋， 即10-1、10-2……10-10， 每個(gè)稀釋度取100μL 加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每個(gè)稀釋度作8 個(gè)重復(fù)， 并設(shè)空白細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照。置24°C 培養(yǎng)箱中。逐日觀察細(xì)胞病變， 并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)。按Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度TCID50值。

1.3.3 CSC 對(duì)CyHV-2 傳代的穩(wěn)定性 采用CSC細(xì)胞對(duì)1.3.1分離的病毒進(jìn)行傳代， 傳代至第7代次， 保存每代次的病變細(xì)胞用于CyHV-2的檢測(cè)。病變細(xì)胞的總DNA采 用 DNAzol 進(jìn) 行 提 取， CyHV-2 檢 測(cè) 引 物 為： CyHV-2-366F： 5′-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTC TAC-3′； CyHV-2-366R： 5′-CCATAGT CACCATCG TCTCATC-3′ (Waltzeket al， 2009)。

1.3.4 CSC 病變細(xì)胞的電鏡觀察 將感染第7 代CyHV-2 的CSC 病變細(xì)胞經(jīng)2%戊二醛固定液(pH 7.2， 0.1mol/L PBS 緩沖液配制)預(yù)固定， 1%四氧化鋨固定液后固定， 再經(jīng)脫水包埋后進(jìn)行超薄切片， 3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后， 透射電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代細(xì)胞特征

采用含20%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)液， 對(duì)處理成小塊的異育銀鯽脊髓組織， 黏附細(xì)胞瓶后， 于24°C 進(jìn)行恒溫靜止培養(yǎng)， 3—4d 后有些細(xì)胞從組織 塊周圍遷出， 細(xì)胞形態(tài)呈成纖維樣(圖2)。待單層細(xì)胞長(zhǎng)至充滿瓶底面積80%—90%時(shí)， 按1 傳2 的方式進(jìn)行傳代。

圖2 原代異育銀鯽脊髓組織細(xì)胞 Fig.2 The spinal cord tissue cells of C. auratus gibelio in the primary culture

2.2 傳代細(xì)胞特征

CSC 細(xì)胞首次傳代， 約30min 可完成貼壁， 群體倍增時(shí)間為48h。連續(xù)傳代 8 次后， 傳代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)速度更趨穩(wěn)定， 3d 后可形成單層細(xì)胞。在傳代至第10 代后， 逐漸減少血清含量至10%， 通過連續(xù)傳代， 采用10%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)液， 24°C 培養(yǎng)， 可對(duì)CSC 細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定培養(yǎng)， 至今CSC 細(xì)胞已傳至128代。獲得穩(wěn)定傳代的第10、第50 和第100 代次CSC細(xì)胞形態(tài)見圖3， 并對(duì)CSC 細(xì)胞進(jìn)行了保藏， 保藏號(hào)為CCTCC NO： C2018211。采用添加細(xì)胞凍存液， 將傳代的細(xì)胞系于液氮中進(jìn)行冷凍保存。

圖3 異育銀鯽脊髓組織細(xì)胞系 Fig.3 Morphology of CSC cells

2.3 傳代細(xì)胞染色體分析

采用秋水仙素使分裂的細(xì)胞停止于分裂中期， 再通過低滲法進(jìn)行染色體觀察。通過對(duì)100 個(gè)分裂相細(xì)胞的觀察， 第26 代異育銀鯽脊髓組織來源細(xì)胞的染色體數(shù)分布在152—160 之間(圖4a)， 41%的細(xì)胞都含有156 條染色體(圖4b)， 表明該細(xì)胞的宿主為三倍體異育銀鯽。

2.4 CSC 細(xì)胞對(duì)CyHV-2 的敏感性

圖4 第26 代異育銀鯽脊髓組織細(xì)胞系的染色體 Fig.4 Chromosomes of CSC cells at passage 26

圖5 CSC 細(xì)胞感染CyHV-2 后的病變特征 Fig.5 CPE features of CyHV-2 infected CSC cells

CyHV-2 陽(yáng)性樣品組織勻漿液感染CSC 細(xì)胞單層(圖5a)， 并以含2%血清的L-15 維持液培養(yǎng)， 逐日觀 察細(xì)胞病變(CPE)， 感染后第3 天細(xì)胞聚合后溶解出現(xiàn)空斑(圖5b)， 感染后第5 天空斑區(qū)域擴(kuò)大(圖5c)， 感染后第7 天細(xì)胞出現(xiàn)大片聚合病變(圖5d)。

2.5 傳代病毒的TCID50 測(cè)定

不同稀釋濃度的病毒裂解液接種96 孔的CSC 細(xì)胞單層后， 連續(xù)觀察9d， 記錄每個(gè)稀釋度的細(xì)胞病變孔數(shù)， 結(jié)果見表1 所示， 按 Reed-Muench 法計(jì)算， 換算成1mL 所含的TCID50為109.33/mL。

表1 TCID50 檢測(cè) Tab.1 Detection of TCID50 in different virus dilutions

2.6 CSC 細(xì)胞對(duì)病毒傳代的穩(wěn)定性

對(duì)收集的第2—7 代次的CyHV-2 細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行DNA 提取， 并進(jìn)行CyHV-2 的檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)第2 代次至第7 代次培養(yǎng)物的總DNA， 都可擴(kuò)增得到366bp的目的片段(圖6)， 表明CyHV-2 在CSC 細(xì)胞中可以穩(wěn)定傳代7 代以上。

圖6 不同培養(yǎng)代次CyHV-2 的PCR 檢測(cè)結(jié)果示意圖 Fig.6 Schematic results of PCR detection of CyHV-2 in different culture passages

2.7 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染CSC 的電鏡觀察

通過透射電鏡觀察感染CyHV-2 后的CSC 病變細(xì)胞， 可觀察到大量直徑在128—134nm 的皰疹樣病毒粒子， 呈球形顆粒狀。說明CyHV-2 在CSC 細(xì)胞中能繁殖、擴(kuò)增(圖7a， 圖7b)。

3 討論

圖7 第7 代CyHV-2 病毒感染CSC 的細(xì)胞電鏡超薄切片示意圖 Fig.7 Schematic view of ultrathin section of the 7th generation CyHV-2-infected CSC cells

魚類細(xì)胞培養(yǎng)的研究始于20 世紀(jì)60 年代， Wolf等(1962)建立了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)生殖腺細(xì)胞系RTG-2。此后， 魚類細(xì)胞系的建立及其相關(guān)研 究進(jìn)展迅速， 迄今為止， 已有300 株左右來自不同品種魚類的不同組織的細(xì)胞系已被建立， 魚類細(xì)胞培養(yǎng)已成為一項(xiàng)重要的技術(shù)， 在病毒學(xué)、免疫學(xué)、魚類資源保護(hù)與遺傳育種、病理學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、魚類生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和轉(zhuǎn)基因等方面的理論及應(yīng)用研究中發(fā)揮作用(Lakraet al， 2011)。而鯽魚組織源的細(xì)胞系也被多位學(xué)者建立， 包括鰭條細(xì)胞系CFS、鯽魚異倍體囊胚細(xì)胞系CAB-800、鯽魚腮蓋膜細(xì)胞系HCC-87、銀鯽魚背鰭細(xì)胞系SCC-DF、鯽魚腦細(xì)胞系GiCB、鯽魚尾鰭細(xì)胞系GiCF 等(陳敏容等， 1985； 李亞男等， 1992； Hasegawaet al， 1997； Maet al， 2015； Luet al， 2018)。

原代細(xì)胞培養(yǎng)主要有組織塊貼壁法、胰蛋白酶消化法、機(jī)械分散法、絡(luò)合劑分散法等(于淼等， 2003)。常用的是組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化法， 比較這兩種原代細(xì)胞培養(yǎng)法的優(yōu)缺點(diǎn)， 組織塊貼壁法更適用于不易消化的組織。根據(jù)前期對(duì)CyHV-2 在鯽魚內(nèi)臟組織分布的研究發(fā)現(xiàn)， 腦和腎臟的病毒含量最高(袁雪梅等， 2019)， 此外， 皰疹病毒容易在神經(jīng)細(xì)胞中進(jìn)行潛伏感染(Grinde， 2013)， 因此， 本研究選擇與腦連接的脊髓組織作為原代細(xì)胞培養(yǎng)的組織源。脊髓組織質(zhì)地松軟， 含有較多不易被消化的組織， 所以選擇組織塊貼壁法對(duì)鯽魚脊髓組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。采用胰蛋白酶消化法對(duì)鯽魚脊髓原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)， 以1︰2 的比例順利獲得傳代。細(xì)胞是否可以長(zhǎng)期凍存和成功復(fù)蘇， 對(duì)于建立穩(wěn)定的細(xì)胞系至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中， 采用液氮保存法， 選取了細(xì)胞冷凍保護(hù)液， 有效避免了因細(xì)胞在降溫過程中形成冰晶而造成的細(xì)胞損壞(陳愛平等， 2011)。

細(xì)胞系是分離病毒性病原的重要材料。而鯽魚來源的對(duì)CyHV-2 敏感的細(xì)胞系較缺乏， 制約了有關(guān)鯽魚皰疹病毒病的研究進(jìn)展。本研究以鯉皰疹病毒Ⅱ型感染CSC 細(xì)胞系后， 細(xì)胞出現(xiàn)了明顯病變效應(yīng)， 在感染第7 天病毒滴度達(dá)到了109.33TCID50/mL。而已報(bào)道的對(duì)CyHV-2 最敏感的細(xì)胞系， 分離的病毒最高滴度只有104.9TCID50/mL (GiCF) (Luet al， 2018) 和107.5TCID50/mL (GiCB) (Maet al， 2015)。這表明CSC細(xì)胞系擴(kuò)增 CyHV-2 的能力更強(qiáng)， 并且分離的CyHV-2 病毒可在CSC 細(xì)胞中穩(wěn)定傳代， 傳代病毒的各代次病毒滴度穩(wěn)定。通過對(duì)固定的病變細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察， 在細(xì)胞中觀察到大量的皰疹樣病毒顆粒， 直徑大小為 128—134nm， 病毒粒子的形狀和大小與CyHV-2 病毒一致(李茂等， 2015)。根據(jù)電鏡觀察到的病毒量， 也間接證明了病毒CyHV-2 可以在CSC 細(xì)胞中進(jìn)行高效的復(fù)制。這為制備鯽造血器官壞死病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗提供了可靠的病毒復(fù)制載體。

4 結(jié)論

綜上， 本研究建立的CSC 細(xì)胞系對(duì)CyHV-2 敏感， 且病毒在該細(xì)胞系中能進(jìn)行穩(wěn)定高滴度地傳代， 因此CSC 細(xì)胞系成為研究CyHV-2 復(fù)制與發(fā)病機(jī)制的有效工具， 還可用于CyHV-2 細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備。以此為基礎(chǔ)研究獲得的CyHV-2 細(xì)胞滅活疫苗將有助于我國(guó)鯽造血器官壞死病的預(yù)防和控制。