朱松梅，方政，董玉瑛

(大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605)

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是日常生活中常用的一類藥物，這些藥物不能全部被生物體吸收，其中的30%～90%都會被排出體外[1]。由于抗生素的濫用和低吸收性，大量抗生素隨著人類活動被排入環(huán)境中。研究表明，污水處理廠對抗生素類污染物的去除率不高，因此抗生素在環(huán)境中殘留產(chǎn)生的危害使其成為研究熱點(diǎn)[2]。紅霉素屬于第1代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由紅霉素鏈霉菌產(chǎn)生，因其具有廣譜抗菌性，抑菌作用好，組織分布廣泛，藥學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且僅有少部分作用對象會出現(xiàn)較輕的不良反應(yīng)，被廣泛用于醫(yī)藥行業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)，是全球范圍內(nèi)環(huán)境檢出率較高的抗生素之一[3]。羅紅霉素是紅霉素的醚肟類衍生物，是半合成的十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，口服吸收療效好，在生物體內(nèi)產(chǎn)生的抗菌效果比紅霉素強(qiáng)1～4倍，且避開了紅霉素會溶于胃酸而失活的缺陷，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，治療多種由于敏感菌株引起的感染性疾病[4]。乙酰螺旋霉素是螺旋霉素的醋酸酯，強(qiáng)效抑菌劑的典型代表，在口服條件下能夠更快地分布到生物體的組織和體液中去，但只有濃度較高時才能起到殺菌作用，相對療效較為緩和，但對耐紅霉素的金黃色葡萄球菌的抑制作用很強(qiáng)，也是治療弓形蟲感染的極為安全有效的一種抑菌藥物[5]。

發(fā)光菌是一種兼性厭氧生物，主要存在于海洋、淡水和陸地環(huán)境中。發(fā)光原理為，熒光素酶氧化了特定的底物熒光素和還原型輔酶，使黃素單核苷酸發(fā)生反應(yīng)。毒物的量或濃度越大，被測生物發(fā)光菌發(fā)出的光越弱，其發(fā)光強(qiáng)度與污染物濃度呈較好的線性關(guān)系[6]。該方法具有快速、靈敏、操作簡單、應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)。那廣水等[7]用發(fā)光菌來評價(jià)排污口污水中總有機(jī)污染物的毒性，并對環(huán)渤海排污口水質(zhì)狀況進(jìn)行評價(jià)?，F(xiàn)選用3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對海洋發(fā)光菌的毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為其對環(huán)境及生物的影響提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為國內(nèi)制定該類抗生素污染效應(yīng)的環(huán)境基準(zhǔn)以及相關(guān)生產(chǎn)行業(yè)的排放標(biāo)準(zhǔn)提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

DXY-2生物毒性測試儀(中國科學(xué)院南京土壤研究所)；THZ-82恒溫振蕩器(江蘇金城國勝試驗(yàn)儀器廠)；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；85-2恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；LDZX-40CI高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；BS214D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

紅霉素腸溶片(西安利君制藥有限責(zé)任公司)；乙酰螺旋霉素片(西南藥業(yè)股份有限公司)；羅紅霉素分散片(哈藥集團(tuán)制藥六廠)。以上3種抗生素均采用校正后的有效成分含量配制，根據(jù)溶液稀釋公式C1V1=C2V2對溶液進(jìn)行配比，使溶質(zhì)濃度符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。其中：C1為稀釋前溶質(zhì)濃度；V1為稀釋前溶液體積；C2為稀釋后溶質(zhì)濃度；V2為稀釋后溶液體積。海洋明亮發(fā)光菌凍干粉(中國科學(xué)院南京土壤研究所)。

1.3 發(fā)光菌培養(yǎng)

(1)發(fā)光菌凍干粉制劑的復(fù)蘇：無菌條件下，取已滅菌的3% NaCl溶液1 mL于明亮發(fā)光菌的凍干粉制劑中均勻混合，常溫下放置2 min即可復(fù)蘇；

(2)斜面菌種的培養(yǎng)：將已復(fù)蘇的發(fā)光菌用已滅菌的接種棒轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，20 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接第二代，相同的操作至第三代后放于冰箱保存?zhèn)溆?，以上操作均須在無菌條件下進(jìn)行；

(3)搖瓶菌液的培養(yǎng)：將上述制得的第三代發(fā)光菌斜面菌菌種轉(zhuǎn)接到含有100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，20 ℃恒溫振蕩，培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用；

(4)工作菌液的制備：吸取一定量的搖瓶菌液于3% NaCl溶液中，充分?jǐn)嚢?，發(fā)光強(qiáng)度控制在 300～900 mV為宜[8]。

1.4 毒性測定

1.4.1 單一毒性EC50的測定

半最大效應(yīng)濃度(EC50)是指能引起50%最大效應(yīng)的濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定大致的濃度范圍，將3種抗生素分別配制至少15個濃度梯度。用移液槍吸取各濃度梯度的樣品溶液2 mL于具塞磨口比色管中，以2 mL 3% NaCl溶液作為空白對照，每組再將0.5 mL的工作菌液加入測試管中，加塞上下振蕩均勻后去塞，暴露15 min時測定發(fā)光強(qiáng)度。每組濃度梯度做2個平行實(shí)驗(yàn)，確保毒性分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。

1.4.2 聯(lián)合毒性EC50的測定

根據(jù)單一毒性測試結(jié)果，繪制毒性作用的效應(yīng)-劑量曲線，獲得紅霉素、羅紅霉素、乙酰螺旋霉素的EC40、EC45、EC50、EC55、EC60所對應(yīng)的質(zhì)量濃度值。將3種待測藥品的5個濃度梯度按照ECX值進(jìn)行等毒性比例設(shè)計(jì)配制二元和三元聯(lián)合體系，將3%的NaCl溶液作為實(shí)驗(yàn)組的空白對照，每組濃度設(shè)置2個平行實(shí)驗(yàn)，確保每組平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%，測定二元及三元聯(lián)合體系抗生素對發(fā)光菌聯(lián)合毒性作用的EC50。

1.5 聯(lián)合毒性評價(jià)方法

多元聯(lián)合體系下的污染物對生物體的聯(lián)合毒性作用類型包括獨(dú)立作用、協(xié)同作用、相加作用(簡單相加作用和部分相加作用)和拮抗作用4種?，F(xiàn)使用相加指數(shù)法(AI)、毒性單位法(TU)、混合毒性指數(shù)法(MTI)對3種抗生素的二元及三元聯(lián)合體系的作用類型進(jìn)行定量判別和分析[9]，M表示各種化合物的毒性之和，M0為M與聯(lián)合作用中各化合物單一毒性的最大值之比，判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 不同評價(jià)指標(biāo)的聯(lián)合作用類型判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.6 數(shù)據(jù)處理

發(fā)光抑制率計(jì)算公式為：

發(fā)光抑制率=(對照發(fā)光強(qiáng)度-實(shí)驗(yàn)樣品發(fā)光強(qiáng)度)/對照發(fā)光強(qiáng)度×100%。

以發(fā)光抑制率對抗生素濃度采用Excel繪圖，得到3種抗生素對發(fā)光菌的單一毒性范圍圖，進(jìn)一步選取對發(fā)光菌抑制率為50%左右的5～7個點(diǎn)作線性圖，根據(jù)線性方程求得相對發(fā)光抑制率為50%時對應(yīng)的藥品濃度，即得該抗生素對發(fā)光菌的EC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一毒性作用測試分析

抗生素濃度和抑制率之間的相關(guān)系數(shù)r，經(jīng)顯著性水平檢驗(yàn)，置信區(qū)間>90%，故3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的濃度與抑制率之間均表現(xiàn)出較好的線性擬合關(guān)系。目前，國內(nèi)外在水體中檢測出的紅霉素質(zhì)量濃度為2.9～2 189 ng/L，羅紅霉素質(zhì)量濃度為20～560 ng/L，乙酰螺旋霉素質(zhì)量濃度為1 800～912 000 μg/L。浮游動植物對此類抗生素非常敏感，較低劑量也會對環(huán)境和生物存在較大威脅[10-12]。3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的單一毒性大小為：乙酰螺旋霉素>紅霉素>羅紅霉素(表2)。有研究人員通過測試部分取代苯和苯并噻唑類污染物的毒性，發(fā)現(xiàn)母體相同的抗生素，其毒性差異由同類化合物中的取代基決定[13-14]，該結(jié)果對本研究單一毒性測試所得到的結(jié)論具有參考意義。3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的分子結(jié)構(gòu)式見圖1(a)(b)(c)，由圖1可以看出，其取代基的結(jié)構(gòu)和數(shù)量均不相同，其毒性效應(yīng)也有差異。研究人員發(fā)現(xiàn)，羅紅霉素比紅霉素具有更長的半衰期和更高的血藥峰濃度，在生物體內(nèi)產(chǎn)生的抗菌效果比紅霉素強(qiáng)1～4倍，且避開了紅霉素會溶于胃酸而失活的缺陷，其作為紅霉素衍生物，它的毒性作用低，變態(tài)反應(yīng)少[4，15]，這與本研究結(jié)論一致。這一結(jié)論的取得以及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素分子中各取代基對抗生素的毒性貢獻(xiàn)，說明大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的分子間相互作用機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。

表2 3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對發(fā)光菌的單一毒性測試

圖1 3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的分子結(jié)構(gòu)式

2.2 二元聯(lián)合體系的聯(lián)合毒性評價(jià)

綜合分析3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的二元聯(lián)合體系對海洋發(fā)光菌的聯(lián)合毒性作用(表3)，當(dāng)以等毒性比例混合時，紅霉素+乙酰螺旋霉素的作用類型為協(xié)同作用，紅霉素+羅紅霉素及羅紅霉素+乙酰螺旋霉素的作用類型為部分相加作用。采用TU法和MTI法對上述2組二元聯(lián)合體系進(jìn)行評價(jià)，得到的評價(jià)結(jié)果相同，而通過AI法對其評價(jià)卻得到拮抗作用的結(jié)論。由于AI法中沒有進(jìn)一步對部分相加作用進(jìn)行詳細(xì)劃分，此外由Moshkovsky所提出的分類也是從傳統(tǒng)分類里的拮抗區(qū)域中再分類得到的部分相加作用和掩蓋作用，故部分相加作用在某種意義上屬于拮抗作用，因此上述評價(jià)結(jié)果歸于拮抗作用類型[16]。根據(jù)2組拮抗類型的二元聯(lián)合體系中得到的AI和MTI值，可推斷拮抗作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋杭t霉素+羅紅霉素>羅紅霉素+乙酰螺旋霉素。根據(jù)拮抗作用的強(qiáng)弱和二元聯(lián)合體系EC50的大小可知，3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素二元聯(lián)合體系的毒性強(qiáng)弱為：紅霉素+乙酰螺旋霉素>紅霉素+羅紅霉素>羅紅霉素+乙酰螺旋霉素。

表3 3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素聯(lián)合毒性評價(jià)參數(shù)

2.3 三元聯(lián)合體系的聯(lián)合毒性評價(jià)

由于二元聯(lián)合體系的毒性評價(jià)結(jié)果中有2組呈現(xiàn)拮抗作用，其原因可能是3種抗生素分子間不同的活性成分相互作用，進(jìn)而降低聯(lián)合體系的總毒性，從而呈現(xiàn)出拮抗作用。而在三元聯(lián)合體系中，多個拮抗體系的相互累加使各抗生素分子間的相互作用更強(qiáng)，致使三元聯(lián)合體系的毒性仍呈現(xiàn)拮抗作用(表3)，這與叢永平等[17]的研究結(jié)果一致。三元聯(lián)合體系的毒性依舊很強(qiáng)，其可能引發(fā)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)引起學(xué)者及公眾的關(guān)注。

2.4 聯(lián)合毒性作用機(jī)制探討及其類型評價(jià)

對于抗生素聯(lián)合體系同時出現(xiàn)拮抗和部分相加作用的評價(jià)結(jié)果，有學(xué)者認(rèn)為其原因是化合物的聯(lián)合體系在以等毒性比例混合后，各化合物都不能占據(jù)主導(dǎo)作用，對發(fā)光菌的毒性更傾向于各自的獨(dú)立作用[18]。結(jié)合發(fā)光菌的發(fā)光原理對聯(lián)合毒性做進(jìn)一步分析，海洋發(fā)光菌在發(fā)光過程中氧化態(tài)的黃素單核苷酸(FMN)與還原態(tài)的黃素單核苷酸(FMNH2)在反應(yīng)過程中具備了傳遞氫(H)的作用，3種抗生素分子中都含有羥基(—OH)，—OH與FMN反應(yīng)形成氫鍵，阻斷FMNH2在氧化還原作用中H的傳遞，影響海洋發(fā)光菌的活性。3種抗生素的分子中均含有氮(N)元素，它能夠作為海洋發(fā)光菌的營養(yǎng)元素對發(fā)光反應(yīng)過程起促進(jìn)作用，同時減弱聯(lián)合體系對發(fā)光強(qiáng)度的抑制作用，呈現(xiàn)出拮抗作用[19-20]。

2.5 不同聯(lián)合毒性評價(jià)方法的比較

為了比較3種不同聯(lián)合毒性評價(jià)方法，對表3中的數(shù)據(jù)做進(jìn)一步處理，認(rèn)為M0-M、MTI-1、AI的數(shù)值大小可以代表聯(lián)合作用的強(qiáng)度[21]。圖2為不同聯(lián)合毒性評價(jià)方法的比較，由圖2可見，(M0-M)數(shù)值波動相對較小，靈敏度較高，因此為該研究體系的推薦評價(jià)方法。同時也可以直觀地看出，紅霉素+羅紅霉素+乙酰螺旋霉素三元體系拮抗作用較弱。

圖2 不同聯(lián)合毒性評價(jià)方法的比較

3 結(jié)語

抗生素單一毒性的差異取決于不同的取代官能團(tuán)、半衰期和血藥濃度等。除紅霉素+乙酰螺旋霉素表現(xiàn)為協(xié)同作用以外，其他二元及三元聯(lián)合體系均呈現(xiàn)不同程度的拮抗作用，對于其在生物體內(nèi)的真實(shí)毒性作用仍須深入研究。3種評價(jià)方法都是聯(lián)合毒性評價(jià)的可行性方法，其中TU法獲得參數(shù)的數(shù)據(jù)波動范圍小，穩(wěn)定性較好，靈敏度較高，為該研究體系的推薦評價(jià)方法。