蛋白質(zhì)打開方式對乳清蛋白酶法交聯(lián)及抗原性的影響

于鑫欣 劉 暢 趙昀晗 徐曉娟 劉之容 張英華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室 哈爾濱150030）

牛乳含有豐富的蛋白質(zhì)，是人類日常飲食中氨基酸和多肽的重要來源。乳清蛋白作為牛乳中的重要組成部分，近年來被廣泛地應(yīng)用在功能食品、嬰幼兒配方奶粉和焙烤食品中[1-2]。許多研究表明，牛乳蛋白過敏在嬰幼兒中是最普遍的食物過敏，發(fā)病率為2%～6%[3-4]。大量研究表明，牛乳清蛋白中的β-乳球蛋白（β-LG）、α-乳白蛋白（α-LA）為主要的致敏原[5-7]。多種哺乳動物的乳中都含有β-LG，并且β-LG 也是牛乳中最主要的乳清蛋白[8]，而人乳中不含有[9]。嬰幼兒食用后常引起過敏反應(yīng)。

加熱是在乳品加工生產(chǎn)中最常見的改性方法[10]，能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過掩蓋或暴露抗原表位來影響抗原性，然而，加熱僅能夠改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，而致敏氨基酸序列不受影響[11]。熱處理通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象而改變應(yīng)變原性，從而影響它們與其它物質(zhì)的相互作用，比如酶法交聯(lián)反應(yīng)[12-13]?；瘜W(xué)試劑處理也是改變食品原料蛋白性質(zhì)的另一途徑[14-15]。但是，應(yīng)用的化學(xué)試劑要充分考慮到安全因素，因此，選用安全的化學(xué)試劑進行蛋白質(zhì)改性具有重要意義。

基于乳清蛋白主要成分的結(jié)構(gòu)特性，采用物理加熱的方法或者添加安全還原劑半胱氨酸，改變α-LA 和β-LG 的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，破壞二硫鍵，以降低其致敏性[16]。本研究采用加熱和半胱氨酸還原這2種能夠使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)打開的方式處理乳清蛋白，考察不同打開方式對蛋白質(zhì)的抗原性以及對其酶法交聯(lián)程度的影響[17]，為生產(chǎn)功能性質(zhì)良好且致敏性低的乳清蛋白制品提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-乳白蛋白，β-乳球蛋白，十二烷基磺酸鈉（SDS），8-苯氨基-1-萘磺酸，甲叉雙丙烯酰胺，美國Sigma（Saint Louis）公司；乳清蛋白，北京泛亞乳品公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase-N），江蘇一鳴精細化工公司；半胱氨酸，天津博迪化工有限公司；丙酰胺烯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羊抗兔IgG，北京索萊寶科技有限公司。其它試劑均為分析純級或生化純級。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2401PC 型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；3K15 高速冷凍離心機，曦瑪離心機（揚州）有限公司；DYY-6C 電泳儀、DYCZ-28A 電泳槽、680 型酶標儀，北京六一儀器廠；F-4500 型熒光分光光度計，日本日立公司；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳清蛋白改性產(chǎn)物的制備

1.3.1.1 加熱改性乳清蛋白樣品的制備 配置質(zhì)量濃度30 g/L，pH 7.0 的乳清蛋白溶液，分別于60，70，80 ℃加熱10 min 后冷卻至室溫。向不同溫度處理后的樣品中加入5 U/g 蛋白的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，37 ℃水浴反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后80 ℃滅酶10 min，取出冷卻至室溫。以原料乳清蛋白為對照，稀釋到一定倍數(shù)后進行固有熒光發(fā)射光譜掃描、表面疏水性、SDS-PAGE 蛋白質(zhì)凝膠電泳、抗原性的測定。

1.3.1.2 半胱氨酸改性乳清蛋白樣品的制備 半胱氨酸溶液配制：半胱氨酸固體在0.1 mol/L 的HCl 中溶解，待溶解完全后用0.05 mol/L NaOH 調(diào)pH 至7.0。

將含有0.05，0.15，0.25 mmol/g 蛋白的半胱氨酸（Cys）的乳清蛋白溶液（乳清蛋白溶液質(zhì)量濃度30 g/L，pH 7.0）于37 ℃水浴30 min，向不同劑量半胱氨酸處理的樣品加入5 U/g 蛋白的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，37 ℃水浴反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后85 ℃滅酶10 min，取出冷卻至室溫。以原料乳清蛋白為對照樣，檢測一系列理化性質(zhì)、功能性質(zhì)、抗原性和結(jié)構(gòu)性質(zhì)。

1.3.2 乳清蛋白改性產(chǎn)物的性質(zhì)分析

1.3.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定 采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）檢測蛋白質(zhì)含量[18]。

1.3.2.2 疏水性的測定

1）固有熒光發(fā)射光譜掃描 將待測蛋白用50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）稀釋至5 mg/mL。于激發(fā)波長280 nm，激發(fā)波狹縫寬度5 nm，發(fā)射波狹縫寬度5 nm，發(fā)射光譜檢測范圍290～420 nm，掃描速度240 nm/min 下進行掃描。

2）表面疏水性的測定 將蛋白質(zhì)樣品用0.01 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH 7.0）由0.5 g/L 梯度稀釋至0.1 g/L，采用1-苯胺-8-萘-磺酸鹽（ANS）熒光探針法[19]測定表面疏水性。

1.3.2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳 參照張杉等[20]的方法進行SDS-PAGE 凝膠電泳。

1.3.2.4 乳清蛋白改性產(chǎn)物抗原性測定 采用間接競爭酶聯(lián)免疫法（IELISA）測定乳清蛋白修飾產(chǎn)物抗原性，參照袁水林等[21-22]的方法。以α-LA 和β-LG 標準品制作標準曲線。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標準差，且試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS Statistics 16.0軟件的One-way AVONA（單因素方差分析）和多組數(shù)據(jù)間的Duncan 法進行統(tǒng)計與分析，P<0.05 表示差異顯著。圖表繪制應(yīng)用Excel（2010）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 疏水性測定結(jié)果

2.1.1 固有熒光性 蛋白質(zhì)內(nèi)部的發(fā)色氨基酸所造成的熒光參數(shù)的變化可以反映出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，其中色氨酸含有能引起最高輻射率和熒光產(chǎn)量的吲哚發(fā)色團，所以色氨酸對蛋白質(zhì)內(nèi)部環(huán)境的敏感性較高。通常，當色氨酸所處結(jié)構(gòu)環(huán)境由疏水性向極性轉(zhuǎn)變時，發(fā)射熒光強度會下降[23]。因此，檢測色氨酸的熒光參數(shù)能夠準確地反映出鄰近區(qū)域蛋白結(jié)構(gòu)的變化情況。

不同加熱溫度與不同半胱氨酸添加量改性乳清蛋白樣品的相對熒光強度測量結(jié)果如圖1所示。

圖1 加熱與半胱氨酸改性乳清蛋白樣品的固有熒光發(fā)射光譜Fig.1 Intrinsic fluorescence emission spectra of whey protein modified by heat and cysteine

由圖1可看出，乳清蛋白改性樣品的熒光強度在發(fā)射波長345 nm 附近達到最大值。加熱與半胱氨酸處理對乳清蛋白的固有熒光性均有很大影響，2種方式處理的乳清蛋白改性產(chǎn)物的相對熒光強度均大于未處理乳清蛋白，且隨著處理乳清蛋白的溫度和半胱氨酸添加量的增加，相對熒光強度也逐漸增加。加熱處理能夠打開蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并暴露乳清蛋白的疏水基團，而半胱氨酸作為一種還原劑，可以改變蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)部的二硫鍵，2種方式對乳清蛋白結(jié)構(gòu)的打開方式不同[24]，但都能夠提高乳清蛋白改性產(chǎn)物的固有熒光性。比較2種不同處理方式對改性乳清蛋白固有熒光性的影響，明顯看出加熱對乳清蛋白的固有熒光性結(jié)果有更大的影響，加熱處理的乳清蛋白改性產(chǎn)物的固有熒光性大于半胱氨酸處理的乳清蛋白改性產(chǎn)物。

2.1.2 表面疏水性 不同加熱溫度與不同半胱氨酸添加量對乳清蛋白樣品的表面疏水性的影響如圖2所示。

從圖2 中可以看出，加熱處理與半胱氨酸處理后的乳清蛋白的表面疏水性均明顯高于原料乳清蛋白，且呈正相關(guān)關(guān)系。說明2種處理能夠使蛋白質(zhì)的疏水基團暴露，增強乳清蛋白的疏水性。然而加熱處理后的乳清蛋白的表面疏水性普遍高于半胱氨酸改性乳清蛋白，采用60 ℃的加熱處理的乳清蛋白的表面疏水性高于采用0.25 mmol/g 蛋白質(zhì)半胱氨酸改性處理的乳清蛋白。該結(jié)果與固有熒光性分析的結(jié)果一致。

圖2 加熱與半胱氨酸處理對乳清蛋白樣品的表面疏水性的影響Fig.2 Effects of surface hydrophobicity of whey protein modified by heat and cysteine

2.2 加熱及半胱氨酸改性對乳清蛋白TGase 交聯(lián)產(chǎn)物的影響

加熱及半胱氨酸改性乳清蛋白產(chǎn)物的SDSPAGE 電泳圖譜如圖3所示。

從圖3（a，b）可以看出，加熱處理的乳清蛋白與原料乳清蛋白的分子質(zhì)量沒有明顯變化，然而加熱溫度達到80 ℃時，在電泳圖相應(yīng)泳道上方可看到少量大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)聚集。這可能是由于較高溫度的加熱使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被打開，增加了基團的暴露和基團間的相互接觸，形成了少量的蛋白質(zhì)共聚物，半胱氨酸的加入對乳清蛋白的分子質(zhì)量同樣沒有影響。添加有TGase 的乳清蛋白樣品（圖a，b 中的2，4，6，8 泳道）條帶明顯存在大分子聚合物的深色區(qū)域。結(jié)果表明，TGase 的加入能夠使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而且分別比較加熱與半胱氨酸改性的交聯(lián)產(chǎn)物可知，加熱處理后進行交聯(lián)所得產(chǎn)物中大分子聚合物含量多于未加熱處理的交聯(lián)乳清蛋白，且當加熱溫度增加時，大分子聚合物的含量也逐漸增加，說明了加熱作為前處理方式，能夠使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到舒展，有助于TGase 交聯(lián)蛋白形成大分子聚合物；半胱氨酸改性乳清蛋白所得的交聯(lián)產(chǎn)物中大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量大于未改性的TGase 交聯(lián)乳清蛋白，當添加量為0.25 mmol/g 蛋白質(zhì)時乳清蛋白交聯(lián)產(chǎn)物形成的共聚物含量最多。比較2種處理方式對TGase 交聯(lián)產(chǎn)物的含量的影響，由電泳圖可知，半胱氨酸改性的顏色明顯深于加熱改性，說明半胱氨酸改性更有利于乳清蛋白的TGase 交聯(lián)。

圖3 加熱與半胱氨酸改性乳清蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic profiles of whey protein modified by heat and cysteine

2.3 加熱及半胱氨酸改性對乳清蛋白抗原性的影響

通過α-LA 和β-LG 的標準曲線計算出原料乳清蛋白、加熱改性乳清蛋白、半胱氨酸改性乳清蛋白中的抗原含量，如表1所示。

表1 加熱及半胱氨酸改性乳清蛋白產(chǎn)物中α-LA 和β-LG 抗原的含量Table 1 Amount of α-LA and β-LG with antigenicity of whey protein modified by heat and cysteine

從表1可以看出，加熱與半胱氨酸處理后乳清蛋白中α-LA 和β-LG 的抗原含量較原料乳清蛋白中抗原含量均有所減少。且溫度在80 ℃時樣品中α-LA 和β-LG 的含量最少，為6.103 μg/mL和35.58 μg/mL，抗原性下降20%左右；半胱氨酸添加量為0.25 mmol/g 蛋白質(zhì)時，α-LA 含量從原料乳清蛋白中的7.749 μg/mL 減少到5.370 μg/mL；β-LG 的含量則從44.41 μg/mL 減少到29.60 μg/mL，抗原性下降達30%以上。結(jié)果表明半胱氨酸改性比加熱處理更能顯著降低乳清蛋白的抗原性。

3 結(jié)論

3.1 加熱與半胱氨酸改性對乳清蛋白疏水性的影響

加熱與加入半胱氨酸還原劑改性乳清蛋白均能改變其結(jié)構(gòu)，增加乳清蛋白的固有熒光性與表面疏水性。2種處理方式進行比較，結(jié)果表明：熱處理乳清蛋白改性產(chǎn)物的固有熒光性及表面疏水性比半胱氨酸改性產(chǎn)物高，且加熱方法對乳清蛋白的疏水性影響較半胱氨酸改性方法大。

3.2 加熱與半胱氨酸改性對乳清蛋白TGase 交聯(lián)的影響

加熱處理有利于TGase 交聯(lián)蛋白形成大分子聚合物，且加熱溫度增加時，大分子聚合物的含量也逐漸增加。半胱氨酸改性同樣有利于乳清蛋白的TGase 交聯(lián)，且添加量越多，交聯(lián)產(chǎn)物越多。SDS-PAGE 結(jié)果表明半胱氨酸改性得到的大分子交聯(lián)產(chǎn)物含量更多，說明半胱氨酸更有利于乳清蛋白的TGase 交聯(lián)。

3.3 加熱與半胱氨酸改性對乳清蛋白抗原性的影響

加熱處理使乳清蛋白中抗原含量下降20%左右，半胱氨酸改性使乳清蛋白中抗原含量下降達30%以上。結(jié)果表明半胱氨酸改性比加熱處理更能顯著降低乳清蛋白的抗原性。