黨苗苗，丁海娥，楊晨曦，從丙超，趙晨，趙彩霞，邵軼群，高楊

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124）

金蓮花，又稱旱荷、旱蓮花寒荷，為毛茛科金蓮花屬的植物，一年生或多年生草本。金蓮花有清熱解毒，消炎止痛，清熱散風(fēng)，平肝明目的功效。為探究金蓮花內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物活性，通過對興隆山金蓮花的內(nèi)生菌分離純化，確定其種類和數(shù)量并分析其形態(tài)學(xué)特征，為后期探究具有高度開發(fā)價值的有生物活性的天然產(chǎn)物新型生物資源奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)所用植物的材料來源

采自蘭州市榆中縣興隆山的金蓮花，由指導(dǎo)老師郭俊珍老師鑒定。

1.2 儀器與設(shè)備

量筒、玻璃棒、燒杯、培養(yǎng)皿、錐形瓶、電子分析天平、VS-1300-U超凈工作臺、生化恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱

1.3 藥品與試劑

75%酒精、升汞0.1%、葡萄糖、瓊脂粉、注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的制作

稱取200g土豆，洗去泥沙，去皮切塊，利用蒸餾水煮沸至土豆成泥。用八層紗布過濾并將濾液置于燒杯中，向燒杯中加入20g葡萄糖和25g瓊脂，攪拌溶解并轉(zhuǎn)移至1000mL的量筒中進(jìn)行稀釋。分裝，高壓蒸汽鍋滅菌，待溶液降至約55℃時加入青霉素鈉和硫酸鏈霉素于超凈工作臺中倒平板，接種。

2.2 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)

從采樣袋中挑選出葉，莖，根無損傷且無蟲害的金蓮花植株用無菌水沖洗干凈。在超凈工作臺中依據(jù)組織切割法將金蓮花的葉、莖和根切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊，將切割好的小塊于無水乙醇浸泡2min，無菌水漂洗2～3次，而后于0.1%的升汞溶液中浸泡2min再次用無菌水漂洗2～3次后，用無菌濾紙吸干表面的水分。將滅菌后的小塊置于制好的培養(yǎng)基上，每板放置5塊片，密封膜密封，于27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d。

將最后的漂洗液涂布于一個平板內(nèi)一起放入培養(yǎng)箱中，觀察是否有細(xì)菌長出，以檢驗(yàn)上述操作是否滅菌完全。

3.3 分離純化

菌落出現(xiàn)在切口。根據(jù)菌落形態(tài)，色差和生長時間，挑取每個菌落的邊緣菌絲并轉(zhuǎn)移到分離培養(yǎng)基平板進(jìn)行再培養(yǎng)。培養(yǎng)數(shù)天后，觀察并記錄菌落的形態(tài)。最后一次沖洗后取少量表面消毒的無菌水，將其涂于含有硫酸鏈霉素（100U/mL）和青霉素鈉（80U/mL）的分離介質(zhì)上，并在30℃下孵育。觀察是否有任何真菌長出作為無菌處理的參考。

將獲得的菌株反復(fù)純化并培養(yǎng)。菌株編號后，將其轉(zhuǎn)移到PDA傾斜培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5～7d，并儲存在4℃冰箱中。

4 結(jié)果

表1

從新鮮蒲公英根部（J-1）、莖部（J-2）、葉（J-3）部分離獲得7株內(nèi)生真菌，分別編號JH1-JH7。

5 分析

從金蓮花內(nèi)分離得到的內(nèi)生真菌，菌落形式不一，菌絲形態(tài)也不盡相同。有絲，絮，團(tuán)狀，顆粒等。菌落的顏色和色素沉著有相似性。有常見的菌落顏色，如白色和黑色，以及淡黃色，灰色，淺紅色等；邊緣呈羽毛狀，纖毛狀和顆粒狀等，進(jìn)一步表明內(nèi)生真菌的生物多樣性。

6 期望

目前，隨著中草藥的普及與使用，中草藥的開采與利用的合理性有待商榷。而中草藥組織中活性物質(zhì)的含量一般都較低，有且僅有某個生長階段或組織器官中存在，很有可能會出現(xiàn)過度開采與利用，導(dǎo)致生態(tài)問題和社會問題的出現(xiàn)，利用植物內(nèi)生真菌共生效應(yīng)恰好解決了這一問題，這對保護(hù)珍稀藥用植物具有重大的生態(tài)學(xué)意義[2]，那么藥用植物內(nèi)生真菌的分離純化及鑒定技術(shù)則顯得尤為重要。