葛晨玲，蔣康富，石大麗，霍孔林，宋星星，韋德源，胡傳活，王曉曄

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530000；2.東營市畜牧局，東營 257091）

紅斑丹毒絲菌（Erysipelothx rhusiopathiae）是一種纖細或微彎曲的兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，可廣泛感染各種動物引發(fā)丹毒[1]。豬感染紅斑丹毒絲菌后，通過扁桃體和消化道及其他淋巴組織進入血液，主要臨床表現(xiàn)為急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎[2]。豬丹毒曾作為我國“三大豬傳染性病”之一，嚴重影響我國畜牧業(yè)健康發(fā)展。隨著疫苗的研制與使用，我國規(guī)?；i場豬丹毒的發(fā)病明顯減少，僅小型豬場和散養(yǎng)戶有零星發(fā)病[3]。但自2012年底以來，豬丹毒在廣西多地復(fù)發(fā)[4]，與此同時，中國上海、湖南、安徽、江蘇、山東等地也頻頻報道感染豬丹毒的案例，并逐年遞增呈現(xiàn)卷土重來的趨勢。

廣西南寧市武鳴區(qū)某規(guī)模化肉豬場有60日齡左右保育豬700余頭，2018年7月，工作人員巡欄發(fā)現(xiàn)急性死亡豬1只，該豬體重可達百余斤，全身紅熱，耳、頸、腹部皮膚發(fā)紺，背部出現(xiàn)菱形或方形疹塊且稍隆起于皮膚表面。與病死豬同欄的大部分豬精神萎靡，不愿走動，臥地不起，體溫可達40℃～42℃，呼吸困難，黏膜發(fā)紺，體表淋巴結(jié)腫大，背部也出現(xiàn)菱形疹塊，見圖1。

圖1 發(fā)病豬臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of sick pigs

現(xiàn)場剖檢病死豬，眼觀呈現(xiàn)典型的急性敗血癥癥狀。腦部大量充血，腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)腫脹充血，呈現(xiàn)暗紅色；肺部鈍圓、腫大，表面覆蓋有纖維素樣物質(zhì)。脾臟呈現(xiàn)褐紅色長條狀，明顯的淤血腫脹；氣管內(nèi)含有大量粉紅色泡沫，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有積液，見圖2。本研究通過對分離到的細菌進行生物學(xué)特性和耐藥基因分析，以期掌握其生物學(xué)特性并為臨床用藥提供指導(dǎo)性意見。

圖2 死亡豬剖檢圖Fig.2 Anatomy of a dead pig

1 材料和方法

1.1 樣品來源2018年7月，廣西武鳴區(qū)某規(guī)模化肉豬場病死保育豬（60日齡左右）。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑TSB營養(yǎng)瓊脂、綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基購自南寧百賽斯生物試劑公司；2×TaqMasterMix、DL2000 DNA marker及細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）購自天根生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌的分離鑒定將采集的樣品在無菌操作環(huán)境下，用平板劃線的方式接種于綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20 h，挑取大小一致，色澤鮮明的單個可疑菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，以觀察細菌的形態(tài)及生物學(xué)特性。

1.4 細菌的16S rRNA的PCR檢測參照細菌DNA提取試劑盒說明書方法提取分離菌株基因組DNA。設(shè)計16S rRNA通用引物。上游引物：5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，下游引物：5'-ACGGCTACC TTGTTACGACTT-3'，引物由華大基因合成。反應(yīng)體系（25 μL）：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補至25μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收后測序，測序結(jié)果與GenBank中參考株的基因序列進行同源性比較。

1.5 生物被膜體外形成測定參考文獻[5]利用TSB肉湯培養(yǎng)分離菌株20 h后，按1∶1000稀釋后，加入到聚丙乙烯無菌培養(yǎng)板中，每孔200 μL；以無菌肉湯作陰性對照。將培養(yǎng)孔分別在28℃和37℃靜置培養(yǎng)24 h，棄菌液洗滌烘干后，采用結(jié)晶紫染色，用乙酸充分溶解后測定570 nm處D值。將陰性對照的平均D值加上其標(biāo)準(zhǔn)差定義為ODC，待測菌株D值與ODC比較，將生物膜形成能力分為4個等級，陰性（-）：D5704ODC。

1.6 毒力基因檢測參考文獻[6-7]擴增神經(jīng)氨酸酶（Sialidase）、莢膜多糖（CPS-A）、黏附素（RspA）、表面保護性抗原（SPaA）4種毒力因子，具體信息見表1，由華大基因合成。反應(yīng)體系（25 μL）：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，相應(yīng)的退火溫度具體見表1；退火30 s，72℃延伸60 s，共34個循環(huán)；72℃終延伸5 min。

表1 毒力基因引物序列信息Table 1 Sequence information of the primers for virulence gene

1.7 藥敏試驗采用WTO推薦的Kirby-Bauer（K-B）紙片瓊脂擴散法測定22種抗菌藥物的耐藥性，參照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）文件（M100-S21）進行結(jié)果判定。

1.8 耐藥基因檢測參考文獻[8-9]擴增β-內(nèi)酰胺酶類blaOXA、blaSHV、blaTEM和磺胺類Sul1、Sul2共5種耐藥基因，具體信息見表2，由華大基因合成。反應(yīng)體系（25 μL）：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，相應(yīng)的退火溫度見表1；退火30 s，72℃延伸60 s，共34個循環(huán)；72℃終延伸5 min。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離鑒定該菌落在含有5%胎牛血清和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)為灰白色、半透明、邊緣齊整、如針尖麥芒樣細小的菌落。經(jīng)鏡檢，該菌呈現(xiàn)稍直或稍彎的桿狀，以單個或鏈狀存在，有絲狀菌毛，無芽孢，無運動性的革蘭氏陽性菌，疑似豬紅斑丹毒絲菌，將其命名為GXWMZD1，見圖3。

表2 耐藥基因引物Table2 Primers for drug resistance genes

圖3 細菌的分離鑒定Fig.3 Isolation and identification of bacteria

2.2 細菌的16S rRNA的PCR檢測分離菌株經(jīng)16S rRNA PCR擴增，結(jié)果顯示，擴增出1條1437 bp的條帶（圖4），與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，與陽性對照相同，且陰性未擴增出條帶，將測序得到的序列與NCBI公布的序列進行同源性比對，結(jié)果表明，分離菌株與豬紅斑丹毒絲菌在基因關(guān)系上最接近，同源性高達99.9%，證實該分離菌株為豬紅斑丹毒絲菌。

圖4 細菌的16S rRNA的PCR檢測Fig.4 PCR detection of bacterial 16S rRNA

2.3 分離菌株的同源性及進化樹分析利用DNAStar軟件對所測序列和GenBank中公布的國內(nèi)外豬丹毒桿菌的16S rRNA序列進行比對，具體菌株信息見表2，該菌株與比對菌株的同源性基本為91.9%～99.6%（圖6），與中國廣西2014年分離株Er.GXGG-1同源性最高，可達99.6%。經(jīng)遺傳進化樹分析，結(jié)果表明，分離菌株GXWMZD1與來自中國廣東的GD-GZ菌株位于同一分支上，與ZYL、SY1027、WC14.1、QY13.1、Er.GXGG-1等菌株分離地同為中國，且處于同一分支上（圖7）。

表3 同源關(guān)系比對菌株信息表Table 3 Homologous relationship comparison strain information table

圖5 16S rRNA基因核苷酸序列同源性比對Fig.5 Homology comparison of 16S rRNA gene nucleotide sequence

圖6 16S rRNA基因核苷酸序列遺傳進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of 16S rRNA gene

2.4 生物被膜體外形成測定結(jié)果采用微孔板半定量粘附法對生物被膜體外形成進行測定，結(jié)果顯示，分離菌株在28℃培養(yǎng)24 h后，D570的平均值為1.615，標(biāo)準(zhǔn)差為0.322，陰性對照為0.157，標(biāo)準(zhǔn)差為0.090，表明分離菌株在28℃形成能力適中（4+），分離菌株在37℃培養(yǎng)24 h后，D570的平均值為0.517，標(biāo)準(zhǔn)差為0.177，陰性對照為0.090，標(biāo)準(zhǔn)差為0.011，表明菌株在37℃形成能力適中（4+），比較分離菌株在28℃和37℃形成生物被膜的能力顯示，28℃更有利于分離菌株的生物被膜形成（圖7、8）。

圖7 生物被膜體外形成結(jié)果Fig.7 Results of biofilm formation in vitro

圖8 生物被膜體外形成結(jié)果統(tǒng)計圖Fig.8 Results of statistical graph biofilm formation

2.5 毒力基因檢測結(jié)果通過PCR的方法擴增莢膜多糖（CPS-A）、黏附素（RspA）、表面保護性抗原（SPaA）、神經(jīng)氨酸酶（Sialidase）4種毒力因子。結(jié)果表明，擴增出CPS-A（1168 bp）、RspA（1186 bp）、SPaA（1800 bp）3種毒力因子，條帶大小與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，與陽性對照相同，且陰性未擴增出條帶，神經(jīng)氨酸酶（Sialidase）未擴增出條帶，具體結(jié)果見圖9。

圖9 毒力因子檢測結(jié)果Fig.9 Results of virulence factor test

2.6 藥物敏感性檢測結(jié)果通過WTO推薦的Kirby-Bauer（K-B）紙片瓊脂擴散法測定22種抗菌藥物的耐藥性，參照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）文件（M100-S21）進行結(jié)果判定。見表3，其中總耐藥率為68.18%（15/22）中介率為13.64%（3/22），僅對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考4種藥物敏感，敏感率只有18.18%（4/22）。對于氨基糖胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類7種藥物的耐藥率可到100.00%，β-內(nèi)酰胺類藥物除頭孢哌酮外，對其余的4種藥物均耐藥，占受試藥物的80.00%，但頭孢哌酮的抑菌環(huán)直徑可達20 mm，屬于中介的邊緣，其敏感度有進一步向耐藥轉(zhuǎn)化的趨勢。

2.7 耐藥基因檢測藥敏結(jié)果顯示分離菌株對β-內(nèi)酰胺類、磺胺類的藥物耐藥率較高，進行針對性的耐藥基因擴增，擴增β-內(nèi)酰胺酶類blaOXA、blaSHV、blaTEM，磺胺類Sul1、Sul2共5種耐藥基因。PCR結(jié)果顯示（圖10），擴增出blaTEM（788 bp），Sul2（435 bp）2種耐藥基因，與目標(biāo)條帶的大小一致，陰性未擴增出條帶，該結(jié)果與藥敏實驗的結(jié)果呈現(xiàn)正相關(guān)。

3 討論

本研究從某規(guī)模化肉豬場急性死亡的保育豬（60日齡左右）中成功分離出1株豬紅斑丹毒絲菌，通過細菌的分離鑒定、16S rRNA的擴增、生物被膜的形成條件等方法對其生物學(xué)特性進行分析。細菌生物膜可作為一種生物屏障系統(tǒng)，使存在于其中的菌體（被膜菌）相對于其單個浮游狀態(tài)的菌體（浮游菌）對抗菌藥物表現(xiàn)出更強的抗性[10]，而胞外基質(zhì)能有效的抑制免疫細胞的吞噬作用[11]。生物膜一旦形成，膜內(nèi)細菌比浮游細菌耐藥性增加100～1000倍以上[12-13]。當(dāng)致病菌通過群體感應(yīng)效應(yīng)形成生物膜，則會導(dǎo)致頑固性疾病難以根治[14-15]。相較于37℃，該分離菌株在28℃時生物被膜體外形成的能力更強。夏季豬場的飼養(yǎng)環(huán)境的平均室溫可達28℃，一些圈舍設(shè)備、飼槽上的細菌可能乘機肆意生長，體外被膜的形成助長其對消毒劑的抗性，為疾病的形成提供了溫床。

表4 藥物敏感性試驗結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity test

圖10 分離細菌耐藥基因檢測Fig.10 Detection of isolated bacterial resistance genes

本研究通過藥物敏感性試驗、耐藥基因的檢測等試驗方法，對分離菌株的耐藥情況進行鑒定。對于受試的22種藥物來說，該菌株僅對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考4種藥物敏感，敏感率僅為18.18%（4/22），且擴增出β-內(nèi)酰胺酶類blaTEM（788 bp），磺胺類Sul2（435 bp）2種耐藥基因。由此可見，該菌株的藥物敏感性差，耐藥譜廣，多重耐藥情況嚴重。本研究與陸英杰等[16]對從廣東分離的5株豬紅斑丹毒絲菌均對林可霉素耐藥、恩諾沙星敏感的結(jié)果一致，與陸萍等[17]對安徽分離到的28株豬紅斑丹毒絲菌對氨 西林、青霉素敏感的試驗結(jié)果略有差異，與唐愛明等[18]對湖南長沙分離到的3株豬紅斑丹毒絲菌對磺胺類藥物耐藥的結(jié)果一致，與曾文斌等[19]從江西分離到的2株豬丹毒桿菌對β-內(nèi)酰胺酶類藥物高度敏感的試驗結(jié)果并不相符，這可能與臨床用藥習(xí)慣有關(guān)[20]。目前，大多數(shù)對于豬丹毒紅斑絲菌的研究僅停留于各種藥物的敏感性，并未對耐藥基因進行檢測。本研究表明耐藥表型與耐藥基因呈現(xiàn)正相關(guān)，該菌株為復(fù)合基因型耐藥菌株，應(yīng)加強耐藥性檢測，謹防敏感菌轉(zhuǎn)化為耐藥菌。

綜上所述，本研究已成功分離出1株豬紅斑丹毒絲菌，并對其生物學(xué)特性進行測定，該菌株生長迅速，生物被膜體外形成能力強，擴增出莢膜多糖CPS-A、黏附素RspA、表面保護性抗原SPaA共3種毒力基因，多重耐藥情況嚴重，擴增出β-內(nèi)酰胺酶類blaTEM、磺胺類Sul2 2種耐藥基因。