郝桂英，易 利，鄧 宇，何學(xué)謙

（西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西昌 615013）

枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)（Eurytrema cladorchis）隸屬于吸蟲(chóng)綱（Trematoda）、復(fù)殖目（Digenea）、雙腔科（Dicrocoeliidae）、闊盤(pán)屬（Eurytreama）[1]，在牛、羊胰腺胰管內(nèi)均有寄生，但不如胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)（E. pancreaticum）、腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)（E.coelomaticum）常見(jiàn)[2]。牛、羊感染后可引起消瘦、生長(zhǎng)發(fā)育受阻、生產(chǎn)性能降低等，嚴(yán)重感染時(shí)可引起牛、羊死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可以對(duì)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)進(jìn)行初步鑒定，但由于受宿主、環(huán)境等多種因素的影響，其準(zhǔn)確性、可靠性受到一定的限制。DNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的分類(lèi)學(xué)研究，其中DNA序列分析由于操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、提供的信息豐富，成為研究分類(lèi)學(xué)和種系發(fā)生學(xué)的有力工具之一[3]。

核糖體DNA（rDNA）基因具有高度保守性，在所有細(xì)胞生物中都存在，進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，其序列中不同位置上變化的速度不同。18S rRNA 基因是真核生物染色體上編碼核糖體小亞基RNA的基因，該基因序列高度保守，常用來(lái)分析物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[4]。目前已廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)分子分類(lèi)研究，如雞球蟲(chóng)[5]、兔球蟲(chóng)[6]、馬梨形蟲(chóng)[7]等。用于胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)和腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)分子分類(lèi)的靶基因主要有18S rRNA[8-10]、ITS2[10]，已有胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)核糖體DNA全序列的報(bào)道[11]。但關(guān)于枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)分子分類(lèi)的研究?jī)H見(jiàn)孟加拉共和國(guó)瘤牛源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA和ITS2的報(bào)道[12]。

鑒于此，本研究對(duì)采自四川省涼山彝族自治州的9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)樣品的18S rRNA基因部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，并構(gòu)建枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)與其他吸蟲(chóng)的種系發(fā)育關(guān)系，從而明確18S rRNA基因能否成為枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)理想的遺傳標(biāo)記，為今后枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)的分子分類(lèi)和種群遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體的采集及保存枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)樣品采自四川省涼山彝族自治州自然感染的9只山羊胰管內(nèi)，用滅菌生理鹽水清洗干凈，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定后，分別編號(hào)為L(zhǎng)S01～LS09，于-20℃保存?zhèn)溆?。分離自同一只山羊的枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)為1個(gè)分離株。

1.2 主要試劑蛋白酶K購(gòu)自Merck公司，2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker、GreenView核酸染料、柱式DNA膠回收試劑盒等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)蟲(chóng)體總DNA提取從冷凍保存的9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)樣品中分別隨機(jī)取出1條，用剪刀剪碎并研磨，加入SDS（1 μg/μL）裂解液和蛋白酶K（10 μg/μL），放入56℃水浴鍋中消化過(guò)夜，然后將消化好的蟲(chóng)體懸液用酚/氯仿法[13]提取蟲(chóng)體總DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定用Zheng等[9]報(bào)道的引物進(jìn)行枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因部分序列的擴(kuò)增。引物序列分別為18SP1：5'-GGCTCATTAAATCAGCTGGTT-3'；18SP2：5'-ACGTTTTACTTCCTCT AAAT-3'。引物序列由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系為50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，引物18SP1、18SP2（10 pmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。同時(shí)，以ddH2O作空白對(duì)照。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸110 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸6 min。反應(yīng)結(jié)束后分別取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶的大小。各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后送上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析檢索GenBank收錄的部分吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列并下載（表1），然后用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對(duì)，MEGA 5.0軟件分析堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比率，基于K2P模型計(jì)算遺傳距離。用DNAStar 中的MegAlign程序進(jìn)行序列同源性分析。用DnaSP 4.0軟件計(jì)算單倍型數(shù)（haplotypes，H）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi）、單倍型多樣性（Haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）。

以豬帶絳蟲(chóng)（Taenia solium，DQ157224）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，采用K2P模型，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ樹(shù)，并進(jìn)行重復(fù)1000次的自舉檢驗(yàn)（bootstrap test）。

表1 部分吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列信息Table 1 Sequences information of 18S rRNA gene of different flukes

2 結(jié)果與討論

2.1 枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因的序列特征和同源性比較經(jīng)比對(duì)校正剔除多余序列后，本研究測(cè)得的9個(gè)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株的18S rRNA基因部分序列長(zhǎng)度均為1758 bp，A+T堿基的平均含量為47.8%，低于肉牛源胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)齊齊哈爾分離株18S rRNA基因全序列（1996 bp）A+T堿基的平均含量（49%～49.1%）[11]，也與斜睪亞目吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列A+T堿基的平均含量（48.18%～49.23%[17]）的結(jié)果不一致，這可能與序列長(zhǎng)度、宿主、地理位置等有關(guān)。9個(gè)測(cè)序序列均不存在堿基插入/缺失，其中保守位點(diǎn)1753個(gè)，變異位點(diǎn)5個(gè)（簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)1個(gè)、單變異位點(diǎn)4個(gè)）。核苷酸變異位點(diǎn)發(fā)生在密碼子的第三位（占60%）和第一位（占40%）。序列中顛換多于轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換/顛換（R）平均值為1.064，3個(gè)顛換（2個(gè)G-C、1個(gè)T-G）和2個(gè)轉(zhuǎn)換（C-T）。

9個(gè)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株測(cè)序序列的核苷酸同源性為99.9%～100%，堿基變異率為0～0.1%。9個(gè)測(cè)序序列與已知枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性最高（99.7%～100%），與鹿前后盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性最低（92.6%～92.7%），與胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性為99.4%，與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性為99.1%～99.2%，與矛形雙腔吸蟲(chóng)的同源性為97.9%～98.0%，與東方雙腔吸蟲(chóng)、分葉短腺吸蟲(chóng)的同源性均為98.0%～98.1%，與愁體吸蟲(chóng)的同源性為98.5%～98.6%，與華支睪吸蟲(chóng)的同源性為93.9%～94.0%，與肝片吸蟲(chóng)、大片吸蟲(chóng)的同源性為92.9%～93.0%。9個(gè)測(cè)序序列與枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)、胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)、腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)的堿基差異分別為0～0.3%、0.6%、0.8%～0.9%，與愁體吸蟲(chóng)、分葉短腺吸蟲(chóng)、矛形雙腔吸蟲(chóng)、東方雙腔吸蟲(chóng)的差異分別為1.4%～1.5%、2.0%、2.0%～2.1%和2.0%，與其他學(xué)者的報(bào)道稍有差異。鄭亞?wèn)|等[8]報(bào)道腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因部分序列與愁體吸蟲(chóng)、矛形雙腔吸蟲(chóng)的差異分別為1.75%、2.42%。安徽省和福建省腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)和胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的18S rRNA基因序列分別有3個(gè)和4個(gè)堿基的差異[18]。巴西牛源的3個(gè)腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因片段（528 bp）核苷酸同源性為100%，與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)中國(guó)分離株、胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)中國(guó)分離株的同源性分別為99.8%和99.4%[19]；5個(gè)肉牛源胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)齊齊哈爾分離株的18S rRNA基因全序列（1996 bp）的堿基變異為0～0.2%[11]。因此，18S rRNA基因可以作為闊盤(pán)屬吸蟲(chóng)分子分類(lèi)理想的遺傳標(biāo)記基因。

2.2 遺傳多樣性分析9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列共檢測(cè)到3個(gè)單倍型，遺傳距離為0～0.003，平均遺傳距離為0.001。與已知枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)參考序列的遺傳距離為0～0.001，與胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.005～0.006，與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.008，與矛形雙腔吸蟲(chóng)、東方雙腔吸蟲(chóng)、分葉短腺吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.019～0.020，與愁體吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.014～0.015，與華支睪吸蟲(chóng)、肝片吸蟲(chóng)、大片吸蟲(chóng)、鹿前后盤(pán)吸蟲(chóng)的遺傳距離≥0.062。堿基序列總的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）分別為0.417和0.00073，平均核苷酸差異（K）為1.278?？梢?jiàn)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株的變異程度較低。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析基于18S rRNA基因部分序列（1447 bp）構(gòu)建的NJ樹(shù)顯示：9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株與瘤牛源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)孟加拉共和國(guó)分離株親緣關(guān)系最近，聚在同一小支上；然后與牛源胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)福建分離株、牛源腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)福建分離株聚類(lèi)形成闊盤(pán)屬分支，再與愁體吸蟲(chóng)聚為一支，分葉短腺吸蟲(chóng)與雙腔屬的矛形雙腔吸蟲(chóng)、東方雙腔吸蟲(chóng)聚在另一小支上。從圖1可看出闊盤(pán)屬與愁體吸蟲(chóng)的親緣關(guān)系最近，而分葉短腺吸蟲(chóng)與雙腔屬的親緣關(guān)系更近。與其他學(xué)者報(bào)道的結(jié)果相似，F(xiàn)igueira等[19]基于18S rRNA基因片段（528 bp）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示3個(gè)巴西分離株與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)、胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)和愁體吸蟲(chóng)聚在同一支上，且與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)和胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的親緣關(guān)系更近，與矛形雙腔吸蟲(chóng)和東方雙腔吸蟲(chóng)親緣關(guān)系遠(yuǎn)，與大片吸蟲(chóng)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。常巧呈等[10]基于18S rRNA基因的部分序列（1200 bp）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)證實(shí)闊盤(pán)屬和雙腔屬的親緣關(guān)系密切。Su等[11]基于18S rRNA基因全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)位于斜睪亞目雙腔科的分支上，與后睪亞目的親緣關(guān)系最近，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致。

本研究對(duì)采集自涼山州山羊源的枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因的部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)涼山州枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因存在一定程度的遺傳變異，但遺傳變異較低。研究結(jié)果進(jìn)一步支持了18S rRNA基因是復(fù)殖目吸蟲(chóng)分類(lèi)鑒定的理想分子標(biāo)記。

圖1 基于18S rRNA基因部分序列采用NJ法構(gòu)建的枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（支持率標(biāo)注在分支上）Fig.1 Phylogenetic tree of E. cladorchis based on partial sequences of 18S rRNA gene by NJ method（Numbers on the branches indicated the supporting value）