艾拉莫德聯(lián)合MAPK通路抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用

秦理 楊孝兵 劉麗敏 龍小琴 邵豐

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病。該病多發(fā)于手、足、腕等關(guān)節(jié)，呈對稱分布且易反復(fù)發(fā)作。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的軟骨、關(guān)節(jié)骨等處可見侵襲性破壞且呈不可逆轉(zhuǎn)性，嚴重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)強直、畸形，甚至喪失關(guān)節(jié)功能[1-2]。目前，仍有部分類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者經(jīng)多種抗風(fēng)濕藥物聯(lián)合治療6個月以上仍未緩解的情況[3]。因此，尋找合適的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療方案是臨床中亟需解決的問題。艾拉莫德是用于成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一類新藥，在減輕炎癥反應(yīng)、緩解臨床癥狀等方面具有重要作用[4-5]，但對難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎效果仍不滿意。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[6-7]。Pan等[8]發(fā)現(xiàn)阻斷MAPK通路的激活，能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的遷移與侵襲，有助于減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的嚴重程度。本研究通過建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討艾拉莫德聯(lián)合MAPK通路抑制劑p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑1（p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor 1，p38 MAPK-IN-1）的治療作用，以期為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑 艾拉莫德（國藥準字H20110084，規(guī)格：25 mg/片）購自海南先聲藥業(yè)有限公司，4%多聚甲醛、10%乙二胺四乙酸二鈉購自百靈威科技有限公司，p38 MAPK-IN-1（批號：HY-12839，規(guī)格：5 mg）購自美國MedChemExpress公司，二甲基亞砜（批號：D103277，規(guī)格：25 ml/瓶）、PBS（批號：P196987，規(guī)格：500 ml/瓶）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，牛Ⅱ型膠原蛋白購自武漢艾美捷科技有限公司，冰乙酸購自上海麥克林生化科技有限公司，弗氏完全佐劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，番紅O-固綠染色劑購自北京索萊寶科技有限公司，ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.2動物分組與處理 雌性SD大鼠50只，購于浙江大學(xué)動物實驗中心[生產(chǎn)合格證：SCXK（浙）2018-0006]。按隨機數(shù)字表法分成5組：模型組、艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組、聯(lián)合組（艾拉莫德+p38 MAPK-IN-1）、對照組，每組10只。將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于冰乙酸，制成濃度為2 mg/ml的牛Ⅱ型膠原蛋白溶液；4℃過夜，與弗氏完全佐劑按1∶1的比例進行充分混合，制成Ⅱ型膠原蛋白乳劑，在模型組、艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組、聯(lián)合組組大鼠尾根基部皮下多點注射0.1 ml，21 d后同法再次注射以加強免疫反應(yīng)；28 d后大鼠四肢皮膚發(fā)紅、皮溫升高、軟組織腫脹明顯且伴有關(guān)節(jié)強直、不能負重，提示建模成功。對于對照組大鼠，采用同樣方法注射PBS 0.1 ml。參考Hou等[9]研究，建模成功后第2天，艾拉莫德組按25 mg/kg劑量腹腔注射艾拉莫德（溶于0.2 ml二甲基亞砜后再用PBS定容至0.5 ml）；p38MAPK-IN-1組按10 mg/kg劑量注射p38 MAPKIN-1（溶于PBS并定容至0.5 ml），聯(lián)合組給予10 mg/kg的p38 MAPK-IN-1和25 mg/kg的艾拉莫德腹腔注射（艾拉莫德溶于0.2 ml DMSO后加入p38 MAPK-IN-1，用PBS定容至0.5 ml），模型組、對照組給予腹腔注射PBS 0.5 ml。每隔4 d注射1次，共7次。治療期間觀察大鼠踝關(guān)節(jié)一般情況，測量大鼠體重及右后足厚度，評估類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分；治療28 d后斷頸處死大鼠，手術(shù)取足部及整個脛骨下段行番紅O-固綠染色，心臟穿刺取血檢測炎癥因子水平。

1.3 觀測指標

1.3.1 踝關(guān)節(jié)一般情況 觀察5組大鼠踝關(guān)節(jié)一般情況，包括皮膚色澤、皮溫、感染、腫脹、行動能力等。

1.3.2大鼠體重及右后足厚度 在建模前1 d（記為治療0 d）及治療后1、14、28 d使用電子天平測量大鼠體重，游標卡尺測定大鼠右后足厚度。

1.3.3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分 大鼠后足無關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為0分；后足1～2個關(guān)節(jié)發(fā)紅、軟組織腫脹為1分；3～4個關(guān)節(jié)發(fā)紅、軟組織腫脹為2分；≥5個關(guān)節(jié)發(fā)紅、軟組織腫脹為3分；出現(xiàn)嚴重關(guān)節(jié)炎為4分。

1.3.4 滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨破壞情況 采用番紅O-固綠染色法。取大鼠足部及整個脛骨下段，剝?nèi)テつw、肌肉，暴露踝關(guān)節(jié)。4%多聚甲醛固定，10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣處理4周，脫水、浸蠟、切片，行番紅O-固綠染色，晾干后中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)切片滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨破壞等情況。

1.3.5 炎癥因子水平檢測 大鼠心臟血37℃凝固1 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用全自動酶標儀（PT-3502，北京普天新橋技術(shù)有限公司）、ELISA試劑盒檢測大鼠心臟血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 水平，嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠踝關(guān)節(jié)一般情況 模型組大鼠踝關(guān)節(jié)皮膚發(fā)紅，皮溫升高，軟組織明顯腫脹，關(guān)節(jié)強直且不能負重；部分大鼠有明顯的紅斑和潰瘍，行動能力受限明顯。艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組皮膚發(fā)紅、關(guān)節(jié)紅腫等癥狀減輕，皮溫降低，行動能力受限得到改善。聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)腫脹顯著減輕，皮溫明顯降低，行動能力顯著好轉(zhuǎn)。對照組大鼠踝關(guān)節(jié)及后足各項表現(xiàn)均未見異常。

2.2 5組大鼠體重和右后足厚度比較 與對照組比較，模型組大鼠體重和右后足厚度均明顯減少（均P＜0.05）；經(jīng)艾拉莫德、p38 MAPK-IN-1治療后，大鼠體重和右后足厚度均明顯增加（均P＜0.05），其中聯(lián)合組大鼠體重和右后足厚度明顯大于艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組（均 P＜0.05），見表 1。

2.3 5組大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分比較 模型組、艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組、聯(lián)合組大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分分別為（7.46 ± 0.85）、（5.84 ± 0.71）、（5.78 ± 0.74）、（4.17±0.64）分；對照組大鼠后足表現(xiàn)正常，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分為0分。5組大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組、聯(lián)合組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分均明顯降低（均P＜0.05），其中聯(lián)合組明顯低于艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組（均P＜0.05）。

2.4 5組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨破壞情況模型組大鼠踝關(guān)節(jié)表面軟骨帶基本消失；艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組關(guān)節(jié)面軟骨稍有蟲蝕樣改變或變薄，但軟骨帶僅有少量軟骨被侵蝕缺失，連續(xù)性的中斷較少；聯(lián)合組關(guān)節(jié)面軟骨蟲蝕樣改變或變薄程度更低，軟骨帶基本維持完整，連續(xù)性的中斷更少。對照組軟骨組織與骨組織區(qū)分開，見圖1（插頁）。

圖1 5組大鼠踝關(guān)節(jié)切片番紅O-固綠染色所見（嗜堿性的軟骨與番紅O結(jié)合呈現(xiàn)紅色，嗜酸性的骨與固綠結(jié)合呈現(xiàn)綠色或藍色，×100）

2.5 5組大鼠血清炎癥因子水平比較 5組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與對照組比較，模型組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 水平明顯升高（均 P＜0.05），而 IL-10水平明顯降低（P＜0.05）；艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯低于模型組而高于聯(lián)合組（均P＜0.05），IL-10水平明顯高于模型組而低于聯(lián)合組（均 P＜0.05），見表 2。

3 討論

目前，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要治療方法有傳統(tǒng)藥物治療、外科手術(shù)、生物制劑治療等[10-11]，但未能滿足有效控制病情的需要。隨著對其發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)一些具有抑制免疫球蛋白和細胞因子生成、抗炎、促骨形成、抗骨吸收作用的小分子調(diào)節(jié)劑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中具有明顯優(yōu)勢[12-13]。本研究對艾拉莫德聯(lián)合MAPK通路抑制劑p38 MAPK-IN-1對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用進行了觀察。

本研究首先利用牛Ⅱ型膠原蛋白構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，然后給予艾拉莫德、MAPK通路抑制劑p38 MAPK-IN-1治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)艾拉莫德、p38 MAPKIN-1治療后大鼠皮膚發(fā)紅、關(guān)節(jié)紅腫等癥狀減輕，足皮溫降低，行動能力受限得到明顯改善，體重和右后足厚度明顯增加，而聯(lián)合組的治療效果更為明顯。體重變化是評價藥物對機體損傷的重要指標，臨床上在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎過程中多以體重變化評估患者的身體狀況[14-15]。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合組大鼠體重大于艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組，表明艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1治療對機體損傷程度較低。此外，本研究還評估了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分，發(fā)現(xiàn)經(jīng)艾拉莫德、p38 MAPK-IN-1治療后，大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎評分明顯降低，其中聯(lián)合組明顯低于艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組，提示艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1治療能明顯改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床癥狀。進一步行番紅O-固綠染色觀察骨質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組大鼠踝關(guān)節(jié)面軟骨侵蝕程度明顯降低，效果優(yōu)于艾拉莫德組、p38 MAPK-IN-1組，與Dai等[16]研究結(jié)果相近。這進一步明確了艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1治療有助于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨損傷的修復(fù)，為艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供了依據(jù)。

表1 5組大鼠體重和右后足厚度比較

表2 5組大鼠血清炎癥因子水平比較（ng/L）

本研究進一步探討了艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPKIN-1治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制，以期為艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1用于臨床提供理論基礎(chǔ)。相關(guān)研究指出，IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎致病的關(guān)鍵因子，能激活破骨細胞，從而促進骨的吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)流失的發(fā)生[17]。Uttra等[18]研究發(fā)現(xiàn)，降低IL-1β、IL-6、NF-κB 、TNF-α 等促炎因子的水平和增加IL-4、IL-10等抗炎介質(zhì)水平，將有助于改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)艾拉莫德、p38 MAPKIN-1治療后大鼠 TNF-α、IL-6、IL-1β 水平低于模型組但明顯高于聯(lián)合組，同時IL-10水平高于模型組而明顯低于聯(lián)合組。這說明艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1治療有助于抑制炎癥反應(yīng)，由此推測艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用可能是通過抑制炎癥反應(yīng)實現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德在抑制花生四烯酸級聯(lián)反應(yīng)方面與選擇性環(huán)氧酶-2作用相似，且能有效抑制成纖維細胞釋放前列腺素[19-20]，從而抑制促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，提高抗炎介質(zhì)IL-10水平，從而有助于骨再生和抑制炎癥反應(yīng)，緩解臨床癥狀。Kanashiro等[21]研究發(fā)現(xiàn)，活化p38 MAPK可通過抑制交感神經(jīng)而促進關(guān)節(jié)中性粒細胞浸潤。相關(guān)研究報道抑制MAPK信號通路可起到抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞的作用[7]。p38 MAPK-IN-1是p38 MAPK的新型高效選擇性抑制劑，具有持續(xù)、低清除和良好的生物利用度[22]。p38 MAPK-IN-1的應(yīng)用能夠有效地抑制p38 MAPK活性，進而抑制炎癥反應(yīng)，減少骨質(zhì)破壞。上述理論進一步解釋了艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1抑制炎癥反應(yīng)、修復(fù)受損軟骨和緩解臨床癥狀的原因。

綜上所述，艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠具有抗炎和保護作用，可能通過抑制炎癥反應(yīng)實現(xiàn)，這為艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性：（1）未探討艾拉莫德聯(lián)合p38 MAPK-IN-1治療的不良反應(yīng)以及對免疫指標的影響；（2）本研究采用艾拉莫德腹腔注射，其吸收和作用效果可能與常規(guī)口服有所不同，均有待后續(xù)深入研究。