姜楚 李文琪 曹洪麟 劉衛(wèi)

摘 要：磷是限制南亞熱帶常綠闊葉林植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素，研究森林群落中優(yōu)勢(shì)木本植物對(duì)低磷脅迫響應(yīng)的內(nèi)在分子機(jī)制具有重要意義。該文以鼎湖山20 hm2固定監(jiān)測(cè)樣地常綠闊葉林中優(yōu)勢(shì)種錐（Castanopsis chinensis）為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)軟件對(duì)錐基因組序列進(jìn)行深入分析。結(jié)果表明：（1）完成了錐基因組參考序列的草圖拼接，結(jié)合大樣地土壤有效磷數(shù)據(jù)，共篩選出37個(gè)顯著性磷響應(yīng)基因，并對(duì)篩選出的錐磷響應(yīng)基因進(jìn)行GO功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)29個(gè)GO注釋分類中屬分子功能類的基因數(shù)最多，共有13條，所涉及的預(yù)測(cè)功能包括磷脂酶D活性、細(xì)胞色素c氧化酶活性、光電子傳遞、過氧化物酶活性等。（2）對(duì)錐磷響應(yīng)基因進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)顯著性富集的1條代謝通路為psbD基因參與調(diào)控的植物光合代謝途徑。在錐生長(zhǎng)期中，有眾多基因與磷代謝相關(guān)，并參與調(diào)控多種生物途徑。其中，psbD基因作為錐葉片主要的磷響應(yīng)基因可通過調(diào)控光合作用來調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，但其功能有待今后進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)鍵詞：錐， 低磷脅迫， 磷響應(yīng)基因， 基因功能， 代謝通路

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）08-1132-08

Abstract：Phosphorus is the key nutrient factor for limiting the plant growth and production in subtropical evergreen broad-leaved forest. It is of great significance to study on the molecular mechanism of dominant species response to low phosphorus stress in the forest community. Castanopsis chinensis ?is the dominant species in 20 hm2 lower subtropical evergreen broad-leaved forest plot in Dinghushan and plays very important role in forest community assembly and maintenance of biodiversity. In this study， high-throughput sequencing technology combined with bioinformatics softwares were used to deep analyze the genome sequence of C. chinensis. Sequencing quality was assessed by FastQC and clean data was demutiplexed by Stacks. The assembly of reference sequence of C. chinensis genome was preliminarily completed by dDocent and the fasta format file of genomic reference sequence totally contained 1 488 contig sequences including forward strand and reverse strand. Sequencing alignment was conducted by Bowtie2 and the individual sequence information was completely aligned to reference sequence. The results were as follows：（1） Pearson correlation analysis was performed using the data of soil available phosphorus content in Dinghushan plot with the result of sequence alignment matrix and the result showed that 37 significant phosphorus-responsive genes were detected. The GO function annotation analysis of the phosphorus-responsive genes found that among the 29 GO annotation classifications， there were 13 genes in the molecular functional class and the predicting functions included NAPE-specific phospholipase D activity， cytochrome-c oxidase activity， electron transporter and peroxidase activity. （2） The predicting function of 11 genes in the class of biological process class involved in RNA splicing， oxidative phosphorylation， photosynthetic electron transport in photosystem Ⅱ. Cellular component class contained nine genes， including chloroplast， integral component of membrane and photosystem Ⅱ. Moreover， the result of KEGG analysis showed that the KEGG terms of 37 genes were significantly enriched to the metabolic pathway of photosynthesis and psbD was the major gene participated in the regulatory process. This study reveals that many phosphorus-responsive genes are involved in the regulation of various biological pathways in the growth stage of C. chinensis under low phosphorus stress. psbD gene is a major phosphorus-responsive gene adjusting plant growth by regulating photosynthesis in leaves. The specific function of psbD gene in C. chinensis needs to be further vertified.

Key words： Castanopsis chinensis， low phosphorus stress， phosphorus-reponsive genes， gene function， metabolic pathway

磷（phosphorus， P）是植物生命活動(dòng)所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，是核酸及磷脂的重要結(jié)構(gòu)組成部分，參與多種酶的激活（Lambers， 2006）。無機(jī)磷酸鹽（Pi）作為P可以被植物體直接吸收的主要生物利用形式，在大多數(shù)自然及農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，其有效性成為限制植物生長(zhǎng)、發(fā)育及產(chǎn)量的重要因素（Zhao et al.， 2018）。為適應(yīng)外部低磷環(huán)境，植物已形成了一系列表型、生理生化、代謝及分子響應(yīng)機(jī)制，促進(jìn)植物對(duì)有效磷的吸收及重分配（李鍵等，2013）。植物對(duì)低磷脅迫的遺傳學(xué)響應(yīng)機(jī)制，主要是通過DNA序列的特異性變化和誘導(dǎo)體內(nèi)某些沉默基因的表達(dá)，使植物形態(tài)和生理上產(chǎn)生適應(yīng)性的變化，從而提高植物對(duì)土壤難溶態(tài)磷的活化及利用效率（馬祥慶和梁霞，2004）。目前，針對(duì)植物響應(yīng)低磷的相關(guān)報(bào)道多限于模式草本植物及農(nóng)作物，對(duì)森林木本植物的相關(guān)研究較少（于嬌妲等，2017）。Fan et al.（2016）對(duì)磷脅迫高耐受性的馬尾松優(yōu)良品系進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定出的98種差異表達(dá)蛋白涉及光合作用、生物合成、能量代謝、次級(jí)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物途徑。Netzer et al.（2018）對(duì)土壤磷充足和磷受限的兩類歐洲溫帶山毛櫸森林生態(tài)系統(tǒng)中的全年山毛櫸枝條組織進(jìn)行極性代謝組和脂質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)植物通過自身調(diào)控不同代謝物在體內(nèi)的分布以適應(yīng)不同磷濃度和不同季節(jié)下的生長(zhǎng)需求，涉及的代謝通路和機(jī)制極為復(fù)雜。因此，分子生物學(xué)方法可為森林群落中木本植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制研究提供新途徑。

鼎湖山20 hm2固定監(jiān)測(cè)樣地（以下簡(jiǎn)稱鼎湖山大樣地）位于廣東省肇慶市鼎湖山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)（112°30′39″—112°33′41″ E、23°09′21″—23°11′30″ N）的核心區(qū)內(nèi)，海拔230～470 m，坡度30°～50°，地形起伏較大（葉萬輝等，2008）。鼎湖山大樣地屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均溫度為20.9 ℃，年平均降雨量為1 927 mm，其中4月—9月為雨季，月降雨量均高于200 mm;11月至翌年1月為旱季，月降雨量少于100 mm。該區(qū)地帶性土壤類型以赤紅壤為主，山地垂直分布有黃壤及山地灌叢草甸土;地帶性植被類型為典型的南亞熱帶常綠闊葉林，保存較為完好（王崢峰等，2000;葉萬輝等，2008）。葉片N∶P反映了土壤氮磷的相對(duì)有效性，當(dāng)N∶P>16時(shí)，則表現(xiàn)為P限制（劉興詔等，2010）。由于地處南亞熱帶地區(qū)，鼎湖山大樣地受高溫多雨的氣候條件影響，土壤風(fēng)化和土壤P流失狀況嚴(yán)重，造成該地區(qū)土壤P缺乏（邵宜晶等，2017）導(dǎo)致該地區(qū)葉片N∶P普遍高于20，證明存在低P限制（Hedin， 2004）。此外，莫江明等（2000）通過研究鼎湖山南亞熱帶常綠闊葉林中植物營(yíng)養(yǎng)元素含量的分配格局，發(fā)現(xiàn)磷對(duì)南亞熱帶常綠闊葉林植物生產(chǎn)力起最主要的限制作用。

錐（Castanopsis chinensis），殼斗科錐屬，常綠闊葉喬木。雌雄同株，風(fēng)媒傳粉，根據(jù)鼎湖山站的物候記錄，鼎湖山錐的花期為3月—4月，果期為5月—11月。錐在鼎湖山大樣地中的重要值排位第一，是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要建群種，對(duì)群落構(gòu)建及生物多樣性維持具有重要意義（葉萬輝等，2008）。目前對(duì)錐的研究主要集中在種子萌發(fā)與擴(kuò)散（楊期和等，2005;杜彥君等，2006）、種群動(dòng)態(tài)（彭少麟和方煒，1995;張?jiān)伱返龋?003）及遺傳分化（王崢峰等，2001;劉孟等，2017）等方面，研究地點(diǎn)多集中于鼎湖山，但對(duì)其受環(huán)境脅迫因子影響下的分子響應(yīng)機(jī)制研究仍較為缺乏。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析手段，為錐自制遺傳模板序列，并探尋其對(duì)土壤限制性因子磷的響應(yīng)基因和這些基因所涉及的生物學(xué)功能以及參與的代謝途徑，以期為群落生態(tài)學(xué)中受環(huán)境影響產(chǎn)生的分子進(jìn)化機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DNA提取和F-MSAP實(shí)驗(yàn)

樣品采自鼎湖山大樣地，共采集381個(gè)錐個(gè)體樣品，每個(gè)體取不同部位新鮮葉片，利用改良的CTAB法進(jìn)行DNA提取。利用Hap Ⅱ、Msp I 與EcoR I 對(duì)基因組 DNA 進(jìn)行雙酶切;再將酶切產(chǎn)物連上接頭，設(shè)計(jì)并篩選引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，利用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。該實(shí)驗(yàn)參考劉孟等（2017）的錐F-MSAP擴(kuò)增優(yōu)化體系。在EcoR I、Hpa Ⅱ/Msp I通用引物的基礎(chǔ)上（Xiong et al.， 1999），在引物前后隨機(jī)添加若干堿基，組合成不同引物，對(duì)用于選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳共篩選出6對(duì)符合實(shí)驗(yàn)條件的引物對(duì)，用于選擇性擴(kuò)增（表1）：E3/H-M2、E5/H-M2、E6/H-M1、E8/H-M1、E8/H-M5、E9/H-M2。擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司利用HiSeq2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2 環(huán)境數(shù)據(jù)信息

該研究中土壤環(huán)境及物種信息均來自鼎湖山大樣地的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。研究對(duì)象錐所在小樣方的土壤理化性質(zhì)、地形因子來源于2005年樣方建立時(shí)測(cè)量的數(shù)據(jù)，該研究分析使用的土壤有效磷數(shù)據(jù)（ap， mg·kg-1）經(jīng)過2014年最新的土樣分析校正（Chen et al.， 2016）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

（1）利用FastQC 0.11.7軟件（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/ projects/fastqc/）對(duì)測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，通過FASTX_Toolkit軟件（http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）去除低質(zhì)量及重復(fù)序列，去除低質(zhì)量的reads，使用fastq_quality_filter命令，設(shè)置最小質(zhì)量閾值（Minimum Quality Threshold）為33，最小長(zhǎng)度（Minimum Length）為80;去除重復(fù)序列，使用fastx_collapser命令，默認(rèn)參數(shù)。（2）對(duì)質(zhì)控后所得的序列利用Stacks軟件（http：//catchenlab.life.illinois.edu/stacks/）中的process_radtags命令根據(jù)barcode序列進(jìn)行樣本拆分，再利用dDocent軟件（http：//ddocent.com/assembly/）進(jìn)行序列拼接。（3）利用Bowtie2軟件，將個(gè)體序列信息比對(duì)到拼接的模板序列上（http：//bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）。（4）環(huán)境因子與個(gè)體基因序列的相關(guān)性，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行Person相關(guān)分析，篩選顯著相關(guān)基因（P<0.05）。（5）利用R 3.4.2對(duì)所得基因利用已有模式植物擬南芥基因注釋信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，完成GO功能注釋及KEGG代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板序列拼接

原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量過濾及樣本拆分后，通過序列拼接軟件操作，得到錐模板參考序列reference.fasta文件，共包含1 488條contig序列（包括正反互補(bǔ)鏈）。

2.2 序列比對(duì)及環(huán)境關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)2014年校正的鼎湖山大樣地土壤環(huán)境數(shù)據(jù)，能夠?qū)?yīng)序列信息的錐個(gè)體共有374個(gè)。共篩選出37條與ap顯著相關(guān)（P<0.05）的基因序列。

2.3 功能注釋及GO富集分析

經(jīng)過基因功能注釋以及GO富集分析，在錐的29個(gè)GO注釋分類中（表2， 圖1），歸類于分子功能（molecular function，MF）的基因最多，共有13條，涉及磷脂酶D活性、RNA結(jié)合活性、鈣離子結(jié)合活性、細(xì)胞色素c氧化酶活性、載流子活性、光電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性、血紅素結(jié)合活性、過氧化物酶活性等功能;歸類于生物學(xué)過程（biological process，BP）的基因共有11條，涉及RNA剪接、有氧呼吸、電子傳遞鏈、脂質(zhì)代謝、mRNA加工、氧化還原過程、氧化磷酸化、磷脂酰膽堿代謝、光系統(tǒng)Ⅱ中光電子傳遞過程、抗氧化反應(yīng)、tRNA加工;歸類于細(xì)胞成分（cellular component，CC）的基因共有9條，包括葉綠體、細(xì)胞膜、線粒體內(nèi)膜、光系統(tǒng)Ⅱ、細(xì)胞壁、呼吸鏈等組分。

2.4 KEGG代謝通路分析

利用超幾何檢驗(yàn)對(duì)KEGG中所有代謝通路進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示，僅有2.7%的基因被注釋到具體的代謝通路中，其中顯著性富集的1條代謝通路（代謝通路ID：ko00195）為psbD基因參與調(diào)控的植物光合代謝途徑，該基因編碼光系統(tǒng)Ⅱ P680反應(yīng)中心D2蛋白（圖2）。

3 討論與結(jié)論

植物對(duì)磷脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制涉及由大量基因及轉(zhuǎn)錄因子等參與的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在低磷脅迫下，植物通過調(diào)控基因表達(dá)來調(diào)節(jié)生長(zhǎng)及代謝途徑以促進(jìn)對(duì)環(huán)境中有效磷的吸收及高效利用（Xu et al.， 2018）。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，能夠?yàn)樯钊氲闹参锘蛐蛄蟹治鎏峁┘夹g(shù)支撐，對(duì)目前無參考基因組信息的物種尤為重要（賈新平等，2014）。基于此，對(duì)錐的基因組測(cè)序信息進(jìn)行系統(tǒng)分析，用以探尋木本植物對(duì)低磷脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因及其調(diào)控機(jī)制。該研究首先利用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)為錐拼接出參考序列，共包含1 488條模板序列，并將374個(gè)個(gè)體序列與模板序列的比對(duì)結(jié)果結(jié)合鼎湖山大樣地土壤ap數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出37條顯著相關(guān)基因。

光合作用與植物生長(zhǎng)和生物量生產(chǎn)密切相關(guān)，植物的生長(zhǎng)依賴于光合作用，磷是葉綠體的重要組成元素，Pi參與重要的Calvin循環(huán)過程，因此磷在光合作用中起關(guān)鍵作用（Gu et al.，2017）。已有研究表明，光合作用對(duì)低磷脅迫敏感，許多參與光合作用的調(diào)控基因在受低磷脅迫時(shí)表達(dá)發(fā)生顯著變化（Slattery et al.， 2017）。研究發(fā)現(xiàn)，大豆中編碼光合過程中重要化合物成分的四個(gè)關(guān)鍵基因PsbZ、PsbN、PsbH和PsbK在磷受限時(shí)表達(dá)下調(diào)，而NADP+依賴的蘋果酸酶基因和兩個(gè)丙酮酸激酶基1-7. 細(xì)胞成分 ?1. 細(xì)胞; 2. 細(xì)胞組分; 3. 細(xì)胞膜; 4. 細(xì)胞器; 5. 細(xì)胞膜組分; 6. 大分子復(fù)合物; 7. 細(xì)胞器組分 。8-12. 分子功能 8. 結(jié)合; 9. 催化活性; 10. 載流子活性; 11. 運(yùn)輸活性; 12. 抗氧化活性。 13-17. 生物學(xué)過程 13. 代謝過程; 14. 細(xì)胞過程; 15. 單有機(jī)體過程; ?16. 應(yīng)激反應(yīng); 17. 定位。

因受低磷誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)（Chu et al.， 2018）。該研究對(duì)已篩選出的與ap顯著相關(guān)的基因進(jìn)一步進(jìn)行了GO功能注釋分析及KEGG富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，錐的29個(gè)GO注釋分類中屬分子功能類的基因最多，共有13條，所涉及的分子功能包括磷脂酶D活性、細(xì)胞色素c氧化酶活性、過氧化物酶活性等。而KEGG富集分析結(jié)果顯示，錐的磷響應(yīng)基因顯著性富集的1條代謝通路為psbD基因參與調(diào)控的植物光合作用。研究表明，植物葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ是植物進(jìn)行光能轉(zhuǎn)化、水的裂解和釋放氧氣的重要蛋白復(fù)合物，psbD基因編碼光系統(tǒng)Ⅱ作用中心D2蛋白，D2和D1蛋白共同構(gòu)成的異源二聚體上結(jié)合著大量與電子傳遞有關(guān)的色素分子及輔助因子（許冰清等，2015）。

植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，主要通過相關(guān)基因參與調(diào)控。該研究結(jié)果表明，在南亞熱帶常綠闊葉林中，植物體吸收的有效磷主要分配給光合作用用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而在低磷脅迫下，植物能夠調(diào)控相關(guān)的磷響應(yīng)基因促進(jìn)有效磷的吸收以及體內(nèi)循環(huán)再分配過程，從而達(dá)到高效利用有限資源。而該研究使用的錐樣品采集于生長(zhǎng)季，植物體吸收的有效磷可能主要用于葉片生長(zhǎng)，因此該研究結(jié)果也可能在一定程度上受到季節(jié)和實(shí)驗(yàn)條件的影響。目前，僅有極少數(shù)樹種成功完成全基因組測(cè)序，木本植物因生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、基因組龐大導(dǎo)致其分子生物學(xué)研究較滯后于草本植物（于嬌妲等，2017），而對(duì)于森林群落中一些優(yōu)勢(shì)樹種而言，分子生物學(xué)研究的技術(shù)進(jìn)步有助于深入闡明其受環(huán)境脅迫影響下發(fā)生的適應(yīng)性進(jìn)化的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)探索調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因功能具有重要生理學(xué)意義。今后可基于該研究結(jié)果，對(duì)不同生長(zhǎng)季參與調(diào)控的主要磷響應(yīng)基因及對(duì)篩選出的顯著基因的具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探究。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）